שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע
Summary
המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.
Abstract
התקפה אלימה חיידקי גנים מוסדרים לעתים קרובות באותה רמת תעתיק על ידי גורמים רבים מגיבים לאותות סביבתיים שונים. כמה גורמים פועלים ישירות על גנים התקפה אלימה; שאחרים שולטים פתוגנזה על-ידי התאמת הביטוי של הרגולטורים במורד הזרם או ההצטברות של הסימנים שמשפיעים מווסת פעילות. אמנם תקנה נחקרה בהרחבה במהלך צמיחה במבחנה , יחסית מעט מאוד ידוע על מה גנים מותאמת במהלך זיהום. מידע זה חשוב כאשר מוצר גן מסוים הוא מועמד התערבות טיפולית. תעתיק גישות כמו RT-PCR כמותי, בזמן אמת, RNA-Seq דרכים רב עוצמה כדי לבדוק ביטוי של גנים ברמה עולמית אבל סובלים אתגרים טכניים רבים כולל שפע נמוכה של RNA חיידקי לעומת מארח ה-RNA, לדוגמה השפלה על-ידי RNases. הערכת תקנה באמצעות עיתונאים פלורסנט הוא קל יחסית, יכול להיות מרובב עם חלבונים פלורסנט עם תכונות ספקטרליות ייחודי. השיטה מאפשרת ניתוח מתא בודד, ייתכן גנים ברקמות כי התערוכה מורכבת תלת מימדי physiochemical ואדריכלות מעברי צבע המשפיעות על רשתות בקרה רגולטריות חיידקי. מידע אובד כאשר הנתונים הם בממוצע באוכלוסייה בצובר. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לכימות ביטוי גנים ב פתוגנים חיידקיים בתוך באתרו. השיטה מבוססת על עיבוד רקמות פשוטה וצפייה ישירה פלורסצנטיות מן הכתב חלבונים. נדגים את התועלת של מערכת זו על ידי בחינת הביטוי של Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), אשר המוצר ג’ין הוא הדרושים לשם התחמקות המערכת החיסונית שיתואר ex-vivo ו ויוו. אנחנו מראים את nuc-gfp מתבטא בחריפות מורסות כליות לחשוף ביטוי גנים הטרוגניות עקב בחלקו לכאורה תקנה מרחבי הפעילות יזם nuc אבצס מעורבת לגמרי עם התגובה החיסונית. השיטה ניתן ליישם כל חיידק עם מערכת גנטית manipulatable, כל דגם זיהום, מתן מידע יקר ערך עבור מחקרים פרה פיתוח תרופות.
Introduction
חיידקים להגיב לשינויים בתנאים פיזיולוגיים והשינויים במצב התזונתי של סביבתם בהבעת באופן שונה גנים הדרושים עבור הסתגלות והישרדות. למשל, פתוגנים אופורטוניסטים ליישב גוף משטחים-יחסית נמוך צפיפות, הם לעתים קרובות לא מזיק. עם זאת, ברגע החיידק חודר חסמים הכימי והפיסי, זה חייב להתמודד עם המארח תא החיסון הגנות נגד וזמינות מזון מוגבלת1. לדוגמה, Staphylococcus aureus והצנרות בערך שליש מאוכלוסיית asymptomatically אבל הוא גם הגורם של העור הרסנית, רקמות רכות זיהומים, דלקת עצם מוגלתית, דלקת פנים הלב, בקטרמיה2. ההצלחה של S. aureus כמו. חיידק מיוחס לעתים קרובות את הגמישות מטבולית שלה, כמו גם ארסנל של גורמים הקשורים השטח, המופרש התקפה אלימה המאפשרים החיידק להימלט למחזור הדם. וישכפלו ברקמות היקפיים 3,4,5. כי המארח למוות בשל מחלת staphylococcal היא אבולוציונית מבוי סתום ו לתחום השידור מארחים החדש6, המחויבות התקפה אלימה גורם הייצור חייב להיות נשלט היטב.
רשת רגולטוריות מורכבות של חלבונים ללא קידוד RNAs מגיב מגוון רחב של גירויים סביבתיים, לרבות תא צפיפות, שלב הצמיחה, גורמים הקשורים נויטרופילים וזמינות חומר מזין, כדי להבטיח כי התקפה אלימה גנים מבוטאים זמן מדויק ובמיקום מארח רקמות7,8,9,10,11,12,13. למשל, מערכת דו קומפוננט SaeR/S (TCS) מסדיר ביטוי של מספר גורמים התקפה אלימה באמצעות את חיישן קינאז (SaeS), הרגולטור (SaeR) בתגובה14. SaeS הוא autophosphorylated על משקע היסטידין שנשמרת בתגובה מארח אותות (למשל, האנושי נויטרופילים פפטידים [HNPs], calprotectin)8,15,16. קבוצת phosphoryl הוא הועבר לאחר מכן שאריות אספרטט על SaeR, הפיכתו כמו חלבון ה-DNA מחייב (SaeR ~ P)17. TCS SaeR/S מסדיר מעל 20 גנים לתרום בפתוגנזה כולל fibronectin מחייב חלבונים (FnBPs), leukocidins ו coagulase14,18,19,20. ניתן לסווג מטרות יעדים ג’ין גבוה-זיקה ואהדה נמוכה, אשר צפויים המושרה ככל שרמת SaeR ~ P עולה כאשר הם נחשפים רמזים שלה21. הפעילות SaeR/S נשלטת על ידי הרגולטורים אחרים של ביטוי גנים כגון מערכת חישה quorum Agr, מדכא. שבולם רעלים חלבון (רוט), את פקטור סיגמה חלופה ב’ (SigB)22,23,24.
nuc ג’ין התקפה אלימה Sae תלוית ב Staphylococcus aureus ו מקודד thermonuclease (Nuc), אשר חיוני עבור בריחה מן neutrophilic extracellular tראפ (רשתות), הפצת במהלך קורס של זיהום25,26. הביטוי של nuc גם בחום עקיף מודחקים מאת CodY בנוכחות חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP27, מודחקים ישירות על ידי החלבון staphylococcal הרגולטור אביזר שרה28,29 , שפעילותם היא מושפעת חמצן (מצב חמצון-חיזור) ו- pH30. בהתחשב בכך sae ו- nuc המוטציות הן הקלוש במודלים של העכבר של זיהום, יש עניין בפיתוח התערבויות כימי המעכבות שלהם26,המקביל פעילויות31. למרות זאת, אין מידע שלהם מנשר במהלך זיהום.
כתבים פלורסנט שימשו כדי לפקח ולכמת ביטוי גנים ברמה תא בודד. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לכימות S. aureus ביטוי גנים במהלך זיהום זה, כאשר יחד עם transcriptome הפרייה analysis, טכניקות הדמיה חזקה כמו הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וספקטרוסקופיה תהודה מגנטית (MRS), יכול לחשוף כמה חיידקים פיזיולוגיה מוסדר vivo, את abundances היחסית של חומרים מזינים בתוך נישות מסוימות. השיטה ניתן ליישם כל פתוגן חיידקי עם מערכת גנטית צייתן.
סקירה של הווקטור אינטגרטיבית הגנום.
PRB4 וקטור אינטגרטיבית הגנום מכיל 500 בסיסים כל אחד מהאזורים ויוצאת של פסאודוגן S. aureus USA300 SAUSA300_0087 כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית. pRB4 נגזרת עמוד השדרה וקטור הרגיש pMAD המכילות את קלטת ההתנגדות אריתרומיצין (ermC) ואת הגן ביתא thermostable-galactosidase bgaB להקרנה כחול/לבן של ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים32. הבונה כתב מהונדס מכיל גם סמן ההתנגדות כלורמפניקול (חתול) לבחירה לאחר הגנום אינטגרציה פלסמיד חיסול, כמו גם אתרי EcoRI ולא מרק פורטנוי שתתיך האזור רגולטוריות לעניין superfolder ירוק חלבון פלואורסצנטי (sGFP) (איור 1). ידוע כי הבחירה של אתר קישור הריבוזום (RBS) משפיע על הפעילות של הכתב, לעיתים קרובות דורש אופטימיזציה אמפירי33. לפיכך, ה-RBS לא מסופק. כאן, באתר איגוד של ריבוזום יליד משמש כדי לספק עבור תבנית יותר טבעי של ביטוי גנים, אך באתרים אחרים עשוי לשמש.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחלות זיהומיות חיידקים הם בעיה בריאות גדל והולך ברחבי העולם עקב הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה גורמים46. בגלל הסתגלות לסביבות מארח חיונית לצמיחה ההישרדות במהלך זיהום, אסטרטגיות מיקוד תוכניות ביטוי גנים המגבירים את הפתוגן כושר יוכיח שימושי רפואית. אחת מהתכניות היא ערכה של גני?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אלכסנדר Horswill על המתנה של PsarAP1– tdTomato פיוז’ן, וכן קרן קרסוול לעזרה עם ניתוח cytometry זרימה. אנו מודים גם המלך אליסה לקבלת ייעוץ על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו הייתה מומן בחלקו על ידי פרס מחקר Exploratory/התפתחותית NIH (גרנט AI123708) וקרנות הפעלה סגל כדי SRB. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, פרשנות או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.
Materials
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
- Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
- Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
- Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
- Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
- Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
- Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
- Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
- Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
- Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
- Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
- Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
- Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
- Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
- Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
- Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
- Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
- Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
- Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
- Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, 2709-2717 (2003).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
- Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, 3075-3090 (2006).
- Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
- Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
- Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
- Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
- Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
- Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
- Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
- Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
- Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
- Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
- Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
- Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
- Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
- Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
- Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
- Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
- Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
- Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
- Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
- Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
- Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
- Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
- Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
- Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).
