Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Las bacterias responden a cambiar condiciones fisiológicas y las alteraciones en el estado nutricional de su entorno expresando diferencialmente genes necesarios para la adaptación y supervivencia. Por ejemplo, patógenos oportunistas colonizan cuerpo superficies en relativamente bajas densidades y suelen ser inofensivos. Sin embargo, una vez que la bacteria ha penetrado las barreras físicas y químicas, deben lidiar con el anfitrión célula inmune contra defensas y restringida la disponibilidad de nutrientes¹. Por ejemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente un tercio de la población de forma asintomática pero también es la causa de la piel devastador e infecciones de tejidos blandos, osteomielitis, endocarditis y bacteremia². El éxito de S. aureus como patógeno a menudo se atribuye a su flexibilidad metabólica, así como un arsenal de factores de virulencia asociados a superficie y secretada que permiten a la bacteria escapar el torrente sanguíneo y replicar en tejidos periféricos ^3,4,5. Porque la muerte del anfitrión debido a la enfermedad estafilocócica es un callejón sin salida evolutivo y límites de transmisión a nuevos anfitriones⁶, debe controlarse cuidadosamente el compromiso con la producción del factor de virulencia.

Una compleja red de regulación de proteínas y no-codificación RNAs responde a una variedad de estímulos ambientales, incluyendo la célula densidad, fase de crecimiento, factores asociados del neutrófilo y la disponibilidad de nutrientes, para asegurar que los genes de virulencia se expresan en la hora exacta y la ubicación en host tejidos^{7,8,9,10,11,12,13}. Por ejemplo, el sistema de dos componentes de SaeR/S (TCS) regula la expresión de varios factores de virulencia a través de la cinasa del sensor (SaeS) y la respuesta de regulador (SaeR)¹⁴. SaeS es autophosphorylated en un residuo conservado de histidina en respuesta a señales (e.g., humano neutrófilos péptidos [HNPs], calprotectina) de host^8,15,16. El grupo fosforilo es entonces transferido a un residuo de aspartato en SaeR, activarlo como una proteína de unión al ADN (SaeR ~ P)¹⁷. El TCS SaeR/S regula más de 20 genes que contribuyen a la patogénesis, incluyendo proteínas de unión de fibronectina (FnBPs), leukocidins y coagulasa^14,18,19,20. Objetivos se pueden clasificar en objetivos gene de alta afinidad y baja afinidad, que son probablemente inducida como el nivel de SaeR ~ P se levanta cuando se exponen a sus señales²¹. La actividad de SaeR/S es controlada por otros reguladores de expresión génica como el sistema de detección de quórum de Agr, represor de las toxinas proteínas (putrefacción) y el factor sigma alternativo B (SigB)^22,23,24.

NUC es un gen de virulencia dependientes de la Sae en Staphylococcus aureus y codifica thermonuclease (Nuc), que es esencial para escapar de neutrophilic extracellular traps (redes) y para su difusión durante la curso de la infección^25,26. La expresión de nuc es también fuertemente indirectamente reprimida por CodY en presencia de los aminoácidos de cadena ramificada y GTP²⁷y directamente reprimida por la proteína estafilocócica regulador accesorio SarA^28,29 , cuya actividad está influenciada por el oxígeno (estado redox) y pH³⁰. Dado que sae y nuc mutantes se atenúan en modelos de ratón de la infección, hay interés en el desarrollo de intervenciones químicas que inhiben sus correspondientes actividades^26,31. A pesar de esto, no hay información con respecto a su regulación durante la infección.

Reporteros fluorescentes se han utilizado para controlar y cuantificar la expresión génica a nivel unicelular. Adjunto, presentamos un método para cuantificar el S. aureus expresión génica durante la infección, cuando se combina con análisis de transcriptoma en vitro y potentes técnicas de imagen como resonancia magnética (MRI) y espectroscopia de resonancia magnética (MRS), puede revelar cómo bacteriana Fisiología está regulada in vivo y la relativa abundancia de nutrientes en ciertos nichos. El método puede aplicarse a cualquier patógeno bacteriano con un manejable sistema de genético.

Resumen del vector integrador de genoma.

El pRB4 vector integrador de genoma contiene 500 pares de bases cada uno de las regiones de aguas arriba y aguas abajo del pseudogene S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar la recombinación homóloga. pRB4 se deriva de la columna vertebral de vector pMAD sensibles a la temperatura que contiene el cassette de resistencia a eritromicina (ermC) y beta-galactosidasa termoestable gene bgaB para azul/blanco cribado de recombinantes³². La construcción de ingeniería reportero también contiene un marcador de resistencia a cloranfenicol (cat) para la selección después de la integración del genoma y eliminación de plásmido, así como sitios de EcoRI y SmaI fusionar la región reguladora de interés verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (figura 1). Se sabe que la elección del sitio de unión a ribosoma (RBS) influye en la actividad del reportero y a menudo requiere optimización empírica³³. Por lo tanto, no se suministra un RBS. Aquí, el sitio de unión del ribosoma nativa se utiliza para proporcionar un patrón natural de la expresión génica, pero pueden utilizarse otros sitios.