Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Bakterien reagieren auf veränderte physiologische Bedingungen und Veränderungen in der Ernährungszustand ihres Umfeldes differentiell zum Ausdruck bringen, Gene, die für Anpassung und das Überleben erforderlichen. Zum Beispiel besiedeln opportunistische Krankheitserreger Körper Oberflächen bei relativ geringer Dichte und sind oft harmlos. Jedoch sobald das Bakterium physikalische und chemische Barrieren eingedrungen ist, muss es mit Host Immunzelle Counter Abwehrkräfte und eingeschränkte Nährstoffverfügbarkeit¹zu kämpfen. Als Beispiel Staphylococcus Aureus kolonisiert ungefähr ein Drittel der Bevölkerung asymptomatisch aber ist auch die Ursache des verheerenden Haut und Weichteilinfektionen, Osteomyelitis, Endokarditis und Bakteriämie². Der Erfolg von S. Aureus als ein Pathogen ist oft seine metabolischen Flexibilität sowie ein ganzes Arsenal an Oberfläche verbunden und sekretierten Virulenzfaktoren, die es das Bakterium ermöglichen zu den Blutkreislauf zu entkommen und zu replizieren in peripheren Geweben ^{zugeschrieben 3,4,5}. Da Host Tod durch Staphylokokken Krankheit eine evolutionäre Sackgasse und Grenzen Übertragung auf neue Gastgeber⁶ist, muss die Verpflichtung zur Virulenz Faktor Produktion sorgfältig kontrolliert werden.

Einem komplexen regulatorischen Netzwerk von Proteinen und nicht-kodierende RNAs reagiert auf vielfältige Reize aus der Umwelt, einschließlich der Zelle Dichte, Wachstumsphase, Neutrophilen-assoziierte Faktoren und Nährstoffverfügbarkeit, um sicherzustellen, dass die Virulenz Gene exprimiert werden, bei der genaue Zeit und Ort im Host Gewebe^{7,8,9,10,11,12,13}. Beispielsweise regelt das SaeR/S zwei-Komponentensystem (TCS) Ausdruck von mehreren Virulenzfaktoren über die Sensor-Kinase (SaeS) und der Reaktion Regler (SaeR)¹⁴. SaeS ist Autophosphorylated auf einen konservierten Histidin Überrest in Reaktion auf Host Signale (z.B., menschlichen Neutrophilen Peptide [HNPs], Calprotectin)^8,15,16. Die Phosphoryl-Gruppe wird dann ein Aspartat-Rückstand auf SaeR, aktivieren es als ein DNA-bindendes Protein übertragen (SaeR ~ P)¹⁷. Die SaeR/S TCS regelt über 20 Gene, die zur Pathogenese einschließlich Fibronektin-bindende Proteine (FnBPs), Leukocidins und Coagulase^14,18,19,20beitragen. Ziele lassen sich einteilen in hohe Affinität und niedrige Affinität gen Ziele, die geeignet sind, als das Niveau der SaeR induzierte ~ P steigt, wenn die Hinweise²¹ausgesetzt. Die SaeR/S-Aktivität erfolgt durch andere Regulatoren der Genexpression wie die Agr-Quorum-sensing-System, Repressor der Toxine Protein (Rot) und die alternative Sigma-Faktor B (SigB)^22,23,24.

NUC ein Sae-abhängige Virulenz gen in Staphylococcus Aureus und kodiert Thermonuclease (Nuc), die wesentlich für die Flucht aus nEutrophilic eXtracellular tRaps (Netze) und für die Verbreitung während der Verlauf der Infektion^25,26. Der Ausdruck der Nuc ist indirekt auch stark unterdrückt von CodY in Anwesenheit von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP²⁷und direkt unterdrückt durch die Staphylokokken Zubehör Regler Protein SarA^28,29 , deren Aktivität wird durch Sauerstoff (Redox-Zustand) und pH³⁰beeinflusst. Angesichts der Tatsache, dass Sae und Nuc Mutanten in Mausmodellen der Infektion abgeschwächt werden, gibt es Interesse an der Entwicklung von chemischen Interventionen, die ihre entsprechende Aktivitäten^26,31zu hemmen. Trotzdem gibt es keine Informationen über ihre Regulierung während der Infektion.

Fluoreszierende Reporter wurden zur Überwachung und Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle zu quantifizieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Quantifizierung der S. Aureus Genexpression während der Infektion, wenn gepaart mit in-vitro-Transkriptom-Analyse und leistungsstarke bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT) und Magnetresonanz-Spektroskopie (MRS), können zeigen, wie bakterielle Physiologie ist in Vivo und die relativen Häufigkeiten von Nährstoffen in bestimmten Nischen geregelt. Die Methode kann für jede bakterielle Erreger mit einem gefügig genetische System angewendet werden.

Übersicht über das Genom integrative Vektor.

Die Genom-integrative Vektor-pRB4 enthält 500 niedrige Paare aus den vor- und nachgelagerten Regionen von S. Aureus USA300 SAUSA300_0087 Pseudogene homologe Rekombination zu erleichtern. pRB4 leitet sich aus dem temperaturempfindliche pMAD Vektor-Backbone mit Erythromycin Widerstand Kassette (ErmC) und thermostabile Beta-Galaktosidase gen BgaB für blau/weiß-Screening von Recombinants³². Veränderter Reporter Konstrukt enthält auch einen Chloramphenicol-Widerstand-Marker (Katze) für Auswahl nach Genom Integration und Plasmid Beseitigung sowie EcoRI und SmaI Sites zu Sicherung die regulatorischen Region von Interesse für Superfolder grün fluoreszierenden Proteins (sGFP) (Abbildung 1). Es ist bekannt, dass die Wahl der Ribosom Bindungsstelle (RBS) die Aktivität des Reporters beeinflusst und häufig empirische Optimierung^{33 erfordert}. Somit wird eine RBS nicht mitgeliefert. Hier die native Ribosom Bindungsstelle wird verwendet, um ein natürliches Muster der Genexpression zur Verfügung stellen, aber andere Websites verwendet werden.