Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Batteri di rispondere alle mutevoli condizioni fisiologiche e alterazioni dello stato nutrizionale del loro ambiente esprimendo differenzialmente geni richiesti per la sopravvivenza e di adattamento. Per esempio, agenti patogeni opportunistici colonizzano corpo superfici a relativamente basso densità e spesso sono innocui. Tuttavia, una volta che il batterio ha penetrato le barriere fisiche e chimiche, esso deve vedersela con contro-difese ospite delle cellule immuni e limitata disponibilità nutriente¹. Ad esempio, lo Staphylococcus aureus colonizza circa un terzo della popolazione senza sintomi ma è anche la causa della devastante della pelle e infezioni dei tessuti molli, osteomielite, endocardite e bacteremia². Il successo di S. aureus come agente patogeno è spesso attribuito a sua flessibilità metabolica, nonché un arsenale di fattori di virulenza secrete e superficie-collegati che permettono il batterio sfuggire il flusso sanguigno e replicare nei tessuti periferici ^3,4,5. Perché la morte di host a causa di malattia stafilococcica è un vicolo cieco dell’evoluzione e la trasmissione di limiti al nuovo host⁶, l’impegno per la produzione di fattore di virulenza deve essere controllato attentamente.

Una rete complessa regolamentazione di proteine e non-codificazione RNAs risponde ad una varietà di stimoli ambientali, tra cui cellulare densità, fase di crescita, fattori neutrofilo-collegati e disponibilità di nutrienti, per garantire che i geni di virulenza sono espresse alla tempo preciso e la posizione all’interno di host tessuti^{7,8,9,10,11,12,13}. Per esempio, il sistema a due componenti SaeR/S (TCS) regola l’espressione di numerosi fattori di virulenza attraverso la chinasi di sensore (SaeS) e la risposta regolatore (SaeR)¹⁴. SaeS è autophosphorylated su un residuo di istidina conservata in risposta a host segnali (ad es., umana del neutrofilo peptidi [HNPs], calprotectina)^8,15,16. Il gruppo fosforile viene poi trasferito ad un residuo di aspartato su SaeR, attivarlo come una proteina legante il DNA (SaeR ~ P)¹⁷. Il TCS SaeR/S regola oltre 20 geni che contribuiscono alla patogenesi tra cui proteine leganti di fibronectina (FnBPs), leukocidins e coagulasi^14,18,19,20. Gli obiettivi possono essere classificati in ad alta affinità e bassa affinità geni bersaglio, che sono probabilmente indotta come il livello di SaeR ~ P aumenta quando esposti a suoi spunti²¹. L’attività di SaeR/S è controllata da altri regolatori dell’espressione genica, come ad esempio il sistema di rilevamento del quorum di Agr, repressore della proteina di tossine (Rot) e il fattore sigma alternativo B (SigB)^22,23,24.

NUC è un gene di virulenza Sae-dipendente in stafilococco aureo e codifica thermonuclease (Nuc), che è essenziale per fuggire da neutrophilic einases traps (reti) e per diffusione durante il corso di infezione^25,26. L’espressione di nuc è anche fortemente indirettamente repressa da CodY in presenza di aminoacidi a catena ramificata e GTP²⁷e direttamente represso dalla proteina stafilococcica accessorio regolatore SarA^28,29 , cui l’attività è influenzata da ossigeno (stato redox) e pH³⁰. Dato che sae e nuc mutanti vengono attenuati in modelli murini di infezione, c’è interesse a sviluppare interventi chimici che inibiscono la loro corrispondente attività^26,31. Nonostante questo, non c’è nessuna informazione per quanto riguarda la loro regolazione durante l’infezione.

Reporter fluorescenti sono stati utilizzati per monitorare e quantificare l’espressione genica a livello di singola cellula. Qui, presentiamo un metodo per quantificare S. espressione genica aureus durante l’infezione che, quando accoppiato con l’analisi del trascrittoma in vitro e potenti tecniche di imaging come la risonanza magnetica (MRI) e la spettroscopia a risonanza magnetica (MRS), può rivelare come batterica fisiologia è regolata in vivo e l’abbondanza relativa delle sostanze nutrienti in alcune nicchie. Il metodo può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico con un sistema genetico trattabile.

Panoramica del vettore integrativo del genoma.

PRB4 di vettore integrativo il genoma contiene 500 accoppiamenti bassi dalle regioni a Monte e a valle del pseudogene di S. aureus USA300 SAUSA300_0087 per facilitare la ricombinazione omologa. pRB4 è derivato dalla spina dorsale di vettore termosensibile pMAD contenente la cassetta di resistenza all’eritromicina (ermC) e beta-galattosidasi termostabile gene bgaB per lo screening blu/bianco di ricombinanti³². La costruzione del reporter ingegnerizzati contiene anche un indicatore di resistenza di cloramfenicolo (cat) per la selezione dopo l’integrazione del genoma ed eliminazione di plasmide, nonché siti EcoRI e SmaI di fondere la regione regolatrice di interesse al verde superfolder proteina fluorescente (sGFP) (Figura 1). È noto che la scelta del sito di legame del ribosoma (RBS) influenza l’attività del reporter e spesso richiede ottimizzazione empirica³³. Così, un RBS non è fornito. Qui, il sito di legame del ribosoma nativo viene utilizzato per fornire per un modello più naturale di espressione genica, ma altri siti possono essere utilizzati.