自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

1. 抗体の精製 注:社内抗体の平衡バッファーは、25 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.5です。使用する溶出バッファーは0.1M酢酸である。緩衝液および樹脂(タンパク質A)は、精製された特異的抗体に依存する。カラム容積は樹脂のベッド高さと同等です。使用されるモバイルフェーズの量は、列のボリュームで決定されます。 精製システムの初期化 精製システムに接続されているソフトウェアを開きます。手動指示を使用して、2 mL/minの流量で平衡バッファでカラムを平衡化し、40分間、平衡化後の手動実行を停止します。 画分コレクターでは、精製された抗体溶出物と50mLの円錐管を収集するために15 mL円錐管を配置し、高塩洗浄時にフロースルーを収集します。実行を開始する前に分数コレクタを開閉して、分数コレクタが開始位置にリセットされていることを確認します。分数のコレクターは7 °Cで維持される。注:分数コレクタは、15 mLチューブと50 mLチューブの両方について、設定の「分数コレクタ」タブの下で手動でリセットできます。 サンプル注入注:以下の手順で使用される収穫された細胞培養液は、自動化されたマイクロバイオリアクター9で培養された中国ハムスター卵巣細胞から得られた。 0.22 μm 濾過された収穫細胞培養液を、ノズル端がキャップされた空の12 mLシリンジに追加します。 ノズルを下に向けたシリンジを持ち、プランジャーの小さな部分が入るまで注射器プランジャーを挿入します。流体が漏れていないことを確認し、ノズルを上にしてシリンジを回し、キャップを取り外します。 ノズルを上向きにしてシリンジを保持し、細胞培養液がノズルの先端になるまで、シリンダーを押して空気を排出します。シリンジノズルを精製システムの手動射出口に挿入し、引き締めるためにねじれます。 すべてのサンプルが注入され、付属の10 mL大容量サンプルループに見えるまでプランジャーを押し下げます。 保存したメソッド ファイルを開きます。結果ファイルを必要な場所に保存し、プロンプトが表示されたときにファイル名を指定します。サンプルが大容量サンプルループに注入された後に実行されます。 精製方法の実行 保存した方法を選択し、計測器ソフトウェアのプロンプトが表示されたときに[実行]をクリックします(ステップ1.2.5)。注: システムは、次の手順を実行するように設定されています。ユーザーは、計測器の実行中に何もする必要はありません。 2 mL/min の流量で平衡バッファーの 3 列ボリューム (CV) でカラムを平衡化します。カラムが平衡化されると、システムは、大容量サンプルループを使用して、1 mL/minの流量でカラムにサンプルを注入します。 280 nm の UV 信号の低下は、サンプルの読み込みが終了したことを示します。紫外線信号が25 mAUを下回るまで、2 mL/minの流量で平衡バッファーでカラムを洗います。 pH 7.5で1M NaClを持つ25 mMトリスの4つのCVを使用して、流量2mL/minの二次高塩洗浄を行います。システム分画コレクターは50 mL管の塩洗浄の間にコラムから外れる蛋白質/DNAを集める。 溶出バッファーの5つのCVを1mL/minの流量で適用し、抗体をカラムから溶出させる。UV信号に基づいて15 mLチューブで溶出物を収集します。UV 280 信号が 35 mAU を超えると、コレクションが開始されます。信号が50 mAUを下回るとコレクションが終了します。これをピークカットと呼び、これをピークカットと呼び、これを使用します。注:ピーク切断は、溶出プロファイルの正規化を保証し、タンパク質凝集体24を含む可能性のある溶出ピークテーリングを回避します。 平衡バッファーの 3 つの CV を使用してカラムを洗浄します。洗浄ステップの後に実行が終了します。 溶出後、1Mトリス塩基を用いて精製タンパク質をpH〜5.5に直ちに中和する。280nmおよび260 nmのマイクロボリュームUV-Vis分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、4°Cで保存します。 遠心単位を用いて精製抗体を濃縮する(ステップ2)。次いで、精製抗体をLC-MSを用いてグリカン分析に行い、凝集プロファイル後はSEC-MALSを用いて分析する(ステップ3&4)。注:精製された抗体は、頻繁な凍結融解サイクルが凝集および沈殿を引き起こす可能性があるため、さらなる緩衝交換なしに凍結してはならない。 2. 精製抗体の濃度 注:トリス酢酸バッファーは、1Mトリスベースで中和された0.1M酢酸を約5.5のpHにします。 遠心管に100 kDaフィルターを挿入します。 フィルターを 500 μL の二重蒸留水で洗います。室温(RT)で14,000 x gで10分間遠心分離機。この手順を 2 回繰り返します。ろ過を破棄します。 すすり付きフィルターを新鮮な遠心チューブに移し、各フィルターに500μLのサンプルを追加します。14,000 x gで10分間遠心分離機。 フィルターを新鮮なスピンチューブに反転させます。濃縮されたサンプルを収集するために1,000 x gで2分間遠心分離機。 UV-Vis 分光光度計を使用してサンプル濃度を決定します。トリスアセテートバッファーの溶液を使用して分光光度計を空白にします。1% (% m/v) IgG 溶液には、タンパク質消滅係数 1.37 mL•(mg•cm)-1を 280 nm で使用します。 濃縮サンプルを使用して、グリカン分析用の2mg/mL作動溶液の12.5 μLと、SEC-MALS用の3.5mg/mL作動溶液の30 μLを調製します。注: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは4°Cで冷蔵する必要があります。2mg/mL濃度では、これらのサンプルは4°Cで少なくとも3ヶ月間安定し、より高い濃度が沈殿する可能性があります。 3. 質量分析法を用いてN-グリカンの分析 N-グリカン標識と分離 中性リン酸ナトリウム、ク硝酸ナトリウムまたはHEPESバッファーなどの適切なバッファーで2mg/mLの抗体濃度から始めます。2mg/mLで無傷のmAb規格(NIST mAbなど)を準備し、実験サンプルと一緒に処理し、陽性対照として機能します。注:抗体は、SDSを含まない最終バッファー内にあり、0.1mM未満の核不球(トリス、DTT、グリシンまたはヒスチジンなど)にする必要があります。サンプル バッファ内の SDS を削除する必要があります。ヌクレオフィラがバッファー内にある場合は、キットに干渉するため、それらを希釈するか、バッファー交換を実行します。一般的なプロトコルは、グリカンキットで提供される。 キットに付属の1mLチューブに15.3μLのLC-MSグレードの水を含む抗体の7.5 μLを希釈し、酵素に優しいMSフレンドリーな界面活性剤の6μLを3分間90°Cで5%溶液で変性させます。 サンプルを室温(RT)まで3分間冷却します。次いで、PNGase Fの1.2 μLを加え、50°Cで5分間インキュベートする。 RTに3分冷却した後、無水ジメチルホルミド(DMF)に溶解した蛍光タグ試薬の12μLを加えて、アセトニトリル(ACN)の358μLで標識されたNグリカン混合物を5分間希釈して、cleavedNグリカンに標識します。 シムと廃棄物トレイを使用した真空マニホールドに親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)プレートを配置します。多数のサンプルにはマルチチャンネルピペットを使用します。 液体がHILIC樹脂を通過するのに15〜30 sかかるように真空が調整される水の200 μLで井戸を調整します。ACN希釈標識グリカン混合物(400μL)をロードする前に、85Nの200 μLで平衡化し、新しい液体をウェルに加えた後に真空を適用します。樹脂を1%ギ酸(FA)/90Nの600μLで2回洗浄します。 廃棄物トレイを600μLの回収管に交換してください。SPE溶出バッファー(各30μLの3つの溶出)を持つ標識されたNグリカンを回収管に溶出します。DMF/ACNサンプル希釈剤の310 μLでプールされた溶出物を希釈します。サンプルを自動サンプラーバイアルにピペットし、蛍光(FLR)-MS分析の準備が整います。注:これらのサンプルは、少なくとも1ヶ月間-80°Cで保存すると安定しています。HILICプレートは、元のパッケージに保存し、テープでシャットし、将来の使用のためにデシケータの中に保管してください。 標識NグリカンのLC-MS分析 蛍光検出器と四重極飛行時間(Q-ToF)質量分析計に結合された超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)システム上の標識されたNグリカン溶出サンプルを分析します。標識されたグリカンのクロマトグラフィー分離に承認されたカラムを使用し、分離中に60°Cに熱します。注: カラムを使用する前に 60% アセトニトリルと 40% H2O でフラッシュする必要があります: 最初の使用前に 50 CV または 20 CV (カラムが以前に使用された場合)。 モバイルフェーズには50mMアンモニウムフォアメイト(AmF)(モバイル相濃縮物で作られた)と100%LC-MSグレードのACNを使用します。AmFはpHの変化に敏感であり、混合した後1ヶ月間使用可能である。初期流量を0.4 mL/minに設定し、LC勾配により溶出フェーズ中にAmFを増加させています。 サンプリングレートが2HzのEX 265/EM 425 nmで測定するFLR検出器を設定し、Q-ToFをMS1正イオン感度モードに設定し、質量範囲を100~2,000ダルトン(Da)、スキャン時間0.25秒、連続データ取得に設定します。内部質量基準には、ルーシンエンケファリン(50N/0.1で2ng/μL)を使用し、「補正を適用しない」モードで使用します。注: 内部質量参照補正は、データ処理中に後で適用されます。 H2O の 22.5 μL、DMF の 25 μL、および ACN の 52.5 μL でデキストラン ラダーを順次再中断します。ラダーは高温(室温、4°C)で24時間以上安定していないため、-80°Cで保存するために10 μLのアリコートを準備します。デキストランはしごは、複数の凍結融解サイクルの後に劣化します。 サンプルを自動サンプラーにセットして10°Cにします。ラダーの保持時間情報は割り当てに使用され、識別の検証に使用される質量情報が割り当てに使用されるため、サンプルと共にデエクストラン ラダーのバイアルを読み込みます。サンプルには10 μLの注入を使用し、はしごには7.5 μLの注入を使用します。三つ三つサンプルを注入する。読み込まれたメソッドを実行します。 LC-MSデータのNグリカン同定 親水性相互作用クロマトグラフィー蛍光質量分析(HILIC-FLR-MS)データに最適化されたプログラムでデータ処理を実行します。 プログラム内で内部質量参照修正を適用します。サンプル情報でデエクストランラダー注射を「標準」として指定します。解析方法では、分離化合物の保持時間を、実行中に検出されたラダー化合物の保持時間に設定します。 特定されたグリカンに対してエリア%が返されるようにするには、[解析方法: [処理]タブで [定量設定- キャリブレーション] をクリックし、「キャリブレーションカーブ適合タイプ」を「相対応答(%)」に設定します。 4. SEC-MALSを用いた抗体凝集の解析 サンプル調製 3.5 mg/mL(ステップ2)希釈タンパク質を150μLガラスインサートでバイアルに移します。気泡の導入を避けるために、インサートの下のベルにピペットにゲルローディングチップを使用してください。 バイアルをセプタキャップでキャップし、すぐに分析します。後で分析する場合は4°Cで保存してください。 SEC-MALSの構成と平衡化注:MALSソフトウェアによって制御されるMALS検出器と屈折指数検出器を用いて超高圧液体クロマトグラフィー(UHPLC)で構成されたSEC-MALSの凝集を分析します。 UHPLCシステムを制御するためのUHPLCソフトウェアの方法ファイルを構成し、流量を1xリン酸緩衝生理食(PBS)の移動相で0.4 mL/minに設定し(10xから希釈)、射出量を5μLに、カラム温度を25°Cに設定します。280 nmを監視するダイオードアレイディテクタ(DAD)。サンプル分析の前に、実行時間を 20 分に設定します。 UHPLCとマルチアングルライト散乱 – 屈折率(MALS-RI)検出器間のインターフェイスは、DAD上のアナログ出力を使用する必要があります。DAD メソッド ファイルの DAD 減衰を 1,000 mAU に設定し、AU/UV 設定を 1 (UVインストゥルメント>チャンネル>チャネル1) に設定します。 解析開始の30分前にDADランプをオンにし、波長を280nmに設定します。同時に、屈折率(RI)参照セルを15分間パージするか、ベースラインが安定するまで参照セルを閉じます。 SEC-MALSソフトウェアシーケンスを設定し、収集時間を12分に設定し、注入量を5μLに、dn/dcを0.185 mL/gに、A280消滅係数を以前に実験的に決定した場合、または1.37 mL*(mg*cm)-1、および濃度サンプル。[実行]をクリックし、[挿入待ち] ダイアログボックスが画面に表示されるまで待ちます。注:A280消滅係数は目的のタンパク質に特異的であり、実験的に決定されるべきである。 UHPLC ソフトウェアのサンプル リストを MALS-RI ソフトウェアと同じ順序で設定し、送信します。注: 実行の前後にシステム適合性チェックを実行することが重要です。ウシ血清アルブミンは、典型的には、ピークの広がりをチェックするために使用され、SECカラムは、洗浄または交換を必要とする可能性があることを示す。同じBSA標準注入を使用して、信号位置合わせ、ピーク拡散、検出器の正規化を指定できます。 MALSソフトウェアを使用した集計分析 [手順] のマークが付いているタブをクリックします。必要な呼吸の最小レベルを指定します。通常はどれも十分です。 ベースラインが正しく描画されていることを確認し、必要に応じて LS1、LS2、LS3、RI、および UV チャネルを調整します。対象のピーク領域を設定します。 分子質量分布を確認して、呼び出されたピークに同じサイズの粒子が含まれていることを確認します。 5. 請求バリアント分析 サンプルの調製とラベリング 3.5 mg/mL抗体溶液の80 μLから始めます。0.5 mL脱塩カラム(7k MWCO)を使用してサンプルを脱塩します。最初に底部ストッパーをスナップしてから、上部ストッパーを緩め、1.7 mLのマイクロ遠心分離管に入れてカラムを準備します。1,500 x gで 1 分間脱塩列を遠心分離します。注: 列の外側にドットをマークして、次のステップの元の方向に配置できるようにします。 カラムを新しいマイクロ遠心分離管に移します。希釈タンパク質の80 μLをカラムの上部に追加します。列を元の方向に揃えます。1,500 x gで2分間遠心分離機。遠心分離機からサンプルを取り出し、脱塩列を捨て、サンプルをよく混ぜます。注:脱塩は、サンプルマトリックスに一次アミン、サンプル電気泳動を乱す賦形剤、またはその他の互換性のない物質が含まれている場合にのみ必要です。 25 μLの体積で2mg/mLの最終濃度にサンプルを希釈し、96ウェルプレートにラベリングバッファーの5 μLを追加します(材料表:チャージバリアント試薬キットを参照)。必要量のラベリング試薬を希釈してラベリング試薬を調剤(ジメチルホルミドで1:30)。。サンプルを光から離れた室温で10分間インキュベートします。注:解凍し、すぐにこの試薬を使用し、DMFと混合の10分以内にそれを使用することが重要です。 インキュベート後、試薬グレードの水を60μL加え、ピペッティングでよく混ぜます。プレートシールでプレートを覆い、1,000 x gで1分間遠心分離します。 充電バリアントチップの準備 貯蔵液を取り除き、井戸1、3、4、7、8、10を水で取り除き、充電バリアントチップを準備します。次に、水を pH 7.2 の実行バッファーに置き換えます(「材料の表: 電荷バリアント試薬キット」を参照)。 pH 7.2 ランニングバッファの750 μLをバッファチューブに追加し、サンプルトレイの左上隅にある示されたスポットにバッファチューブを配置します。次に、96ウェルプレートからプレートシールを取り外し、計測器ユーザーインターフェイスのアンロードプレートを押し、プレートをGXIIサンプルトレイに挿入します。注: pH 7.2 バッファは、この分析に使用されました。pH 5.6-7.2バッファーは、タンパク質pIに応じて使用されてもよい。より低いpHバッファを使用する場合、より長いサンプル実行時間が必要になる場合があります。 ユーザー インターフェイスの[チップのアンロード]ボタンを押します。電極に粒子が含まれていないことを確認し、そうでない場合は糸くずの自由な綿棒できれいにしてください。チップを挿入する際は、チップの中央の窓にパーティクルや汚れがないことを確認します。必要に応じて、糸くずのない柔らかい布で清掃してください。注:毛細血管電気泳動チップを使用する場合は、真空吸引によってバッファを除去し、次の溶液を即座に添加して井戸が乾燥するのを防ぎます。気泡の導入を最小限に抑えるために、リバースピペッティング技術を練習してください。チップを取り扱う場合は、チップの底部から伸びる壊れやすい毛細血管に注意し、乾燥せず、大まかな取り扱いを破らないようにしてください。 蓋をチップチャンバに閉じ、HTタンパク質チャージバリアントアッセイを選択します。[実行]ボタンをクリックします。プロンプトに従って、サンプルウェル、プレートタイプ、アッセイ時間(68、90、または100s)、およびファイル名を選択します。プロンプトの最後にある [開始] をクリックします。 チップのクリーンアップには、各ウェルを水で2x洗浄し、その後にストレージバッファを追加する必要があります(「材料の表:チャージバリアント試薬キット」を参照)。ストレージバッファに入ったら、機器のチップを交換し、プロンプトが表示されたら、HTタンパク質チャージアッセイを選択します。メイン画面で[ユーザーインターフェイスでウォッシュ]を選択します。完成したら、チップを取り出し、水と糸くずのない綿棒で電極を拭き取り、チップを4°Cに保管します。 請求バリアント分析 計測器解析ソフトウェアを開きます。[ファイル>データ ファイルのインポート] に進むことで実行をインポートします。希望する *.gxd ファイルをクリックします。名前だけがソフトウェアに引き継がれるので、ウェルの名前を変更すると有利です (ツール > サンプルネームエディタ)。ファイルを選択しながらシフトを押したままエクスポートするファイルを選択します。[ファイル>エクスポート] をクリックします。を選択し、[生データ]ボックスを選択し、[AIA書式]ボックスを選択します。 解析ソフトウェア内の [プロジェクトの参照] タブを開きます。データベース>データのインポートをクリックし、エクスポートされた *を選択します。CDF ファイル。 インポートしたら、[注射]タブに移動し、分析するファイルを選択し、右クリックして[プロセス]に移動します。ポップアップウィンドウで、[プロセス]の横にあるチェックボックスを選択し、ドロップダウンボックスから「指定した処理方法を使用」ラジオボックスと目的の処理方法を選択します。「方法:」というラベルの下にあるドロップダウン ボックスで、[キャリブレーションと定量化] を選択します。処理が完了したら、[結果] タブに移動し、クロマトグラムの統合を確認します。注: 処理方法は、メソッドごとに検証する必要があります。開始点として、現在の処理方法に使用されるパラメーターが補足ファイルに含まれます。注: データのエクスポートは、レポートの形式で行うか、ピーク定量のみがエクスポートされる場合があります。これらは、処理と同時に、または結果ウィンドウから実行できます。 6. アミノ酸分析 LC-MSによる絶対アミノ酸定量の標準曲線の設定 アスンの59.45mg、59.00mgのヒップ、65.77mgのGln、および0.1 N HClの25 mLでTrpの91.95mgを溶解することにより、拡張アミノ酸(EAA)混合物を調出す。EAA混合物中の各アミノ酸の最終濃度は18nmol/μLである。 HClの50 mLでNvaの58.58 mgおよび44.54 mgのSarを溶解することにより、内部標準(ISTD)ストック溶液を準備します。 Ala、Asp、Arg、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valをそれぞれ1nmol/μLの最終アミノ酸濃度のEAA混合物で組み合わせることで、完全なアミノ酸基準を調融、225、90、22.5、および9 pmol/μL. 90 pmol/μLまたは900 pmol/μLのいずれかの最終濃度のアミノ酸基準に調製されたISTDストックを追加し、この方法の正のコントロールとして使用する「低」および「高」の内部基準を作成します。 アミノ酸濃度をサンプルバイアルに入れ、UPLCのオートサンプラーに入れる。次の指示に従って、アミノ酸標準濃度に基づいて計測器ソフトウェアでキャリブレーション曲線(9~900 pmol/μL)を生成します。 無傷のアミノ酸分析のためのUPLCに結合される電気噴霧イオン化(ESI)正の感受性モードのQ-ToFを使用する。クロマトグラフィー分離には、アミノ酸分離用に作られた通常の位相カラムを使用します。質量分析グレード試薬で以下のバッファーを調味する:A=アセトニトリル+0.1%ギ酸およびB=100 mMアンモニウムフォアメイト。LC流量を0.6mL/minに設定し、カラム温度を40°Cに設定します。 アミノ酸分離には、次の15分間の勾配条件を使用します:14%B(0-3分)、14-100%B(3-10分)、100%B(10-13分)、100-8%B(13-14分)、8%B(14-15分)。 MS取得プログラムの「サンプルタイプ」および「Conc A」列リストを使用して、定量プログラムにおける原油バイオリアクター媒体の将来の分析のためのキャリブレーション曲線を作成します。これらの列を取得プログラムに表示するには、[表示のカスタマイズ]コマンドを使用して、上部のメニュー バーを右クリックします。 アミノ酸規格のサンプルタイプは「標準」、メディアサンプルは「分析」となります。必要な単位(pmol/μLなど)の規格の数値濃度で「Conc A」列に記入してください。 調製したアミノ酸標準濃度を少なくとも2回実行します。ISTDのピークをチェックして、UPLC計測器と質量分析計が正しく動作していることを確認します。 定量アプリケーションの 「編集方法」オプションを使用して、定量メソッド (*.mdb ファイル) を作成します。化合物名、m/z 値、予想保持時間など、定量アプリケーションで関心のあるすべてのアミノ酸を定義します。ここでメソッドの統合パラメータを変更します。 標準サンプルで作成されたアミノ酸法を使用して、キャリブレーション曲線を作成します。このカーブは、エクスポート>キャリブレーションコマンドを使用してメディア サンプルで使用するために *.cdb ファイルにエクスポートできます。 定量アプリケーションで、目的のレイアウトを *.qlt ファイルに保存して、”レイアウトを次のように保存”を使用して将来のデータセットに適用します。名前 (インジェクション名)、エリア、および Conc は最も重要な出力列です。 LC-MSによる粗バイオリアクター培地のアミノ酸分析 遠心分離機粗バイオリアクター媒体を1,962 x gで5分間使用し、0.22 μmフィルターを通過します。 タンパク質と粒子状物質を除去するための過塩素酸クリーンアップをフォローアップ:0.4 N HClO 4で0.4 N HClO4を1:1比で混合し、RTで5分間14,700 x gで遠心分離機を混合します。注:必要に応じて射出量を調整して、アミノ酸濃度をキャリブレーション範囲内に収めます。器械によって、注入容積は0.1 μLと10 μLの間で調節することができる。 LC-MS. 定量プログラムの下で、メソッド (*.mdb) およびキャリブレーション ファイル (*.cdb) と共に「プロセス サンプル」を使用して、メディア サンプルを三つ編みで実行します。メソッドとキャリブレーション曲線は、すべての注入が完了すると、定量アプリケーションによって原油メディアサンプルに自動的に適用されます。 別のプログラム (スプレッドシートなど) で分析用のデータをエクスポートするには、”印刷” コマンドを使用して 、*.xps または *.pdf ファイルを作成します。