Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

1. Purificazione degli anticorpi NOTA: Il buffer di equilibratione per l’anticorpo interno è 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. Il buffer di eluizione utilizzato è di 0,1 M di acido acetico. I tamponi e la resina (Proteina A) dipendono dall’anticorpo specifico purificato. Il volume della colonna è equivalente all’altezza del letto della resina. La quantità di fase mobile utilizzata è determinata in termini di volume di colonna. Inizializzazione del sistema di depurazione Aprire il software collegato al sistema di purificazione. Utilizzando le istruzioni manuali, eclacazione della colonna con il buffer di equilibratione ad una portata di 2 mL/min per 40 min. Interrompere la corsa manuale dopo l’equilibratione. Nel collettore frazionario, posizionare 15 mL di tubi conici per raccogliere l’eluate di anticorpi purificati e tubi conici da 50 mL per raccogliere il flusso attraverso durante la lavaggio ad alto contenuto di sale. Assicurarsi che il raccoglitore frazioni venga reimpostato sulla posizione iniziale aprendo e chiudendo il raccoglitore frazioni prima dell’inizio della conclora. Il collettore di frazioni è mantenuto a 7 gradi centigradi.NOTA: il collettore frazioni può essere reimpostato manualmente nella scheda Raccolta frazioni in Impostazioni, sia per i tubi da 15 mL che per i tubi da 50 mL. Iniezione di campioniNOTA: Il fluido di coltura cellulare raccolto utilizzato nelle seguenti procedure è stato ottenuto dalle cellule dell’ovaio di criceto cinese coltivate in microreattori automatizzati9. Aggiungete il liquido di coltura delle cellule di raccolta filtrato da 0,22 m a una siringa vuota da 12 mL la cui estremità dell’ugello è tagliata. Tenendo la siringa con l’ugello rivolto verso il basso, inserire lo stantuffo della siringa fino a quando una piccola parte dello stantuffo è in. Assicurarsi che il fluido non perda, girare la siringa con l’ugello rivolto verso l’alto e rimuovere il tappo. Tenendo ancora la siringa con l’ugello rivolto verso l’alto, spingere il cilindro per dissipare l’aria fino a quando il fluido di coltura cellulare è sulla punta dell’ugello. Inserire l’ugello della siringa nella porta di iniezione manuale sul sistema di purificazione e torcere per stringere. Spingere verso il basso sullo stantuffo fino a quando tutto il campione viene iniettato ed è visibile nel ciclo di campioni di grandi volumi di grandi dimensioni collegato da 10 mL. Aprire il file del metodo salvato. Salvare il file dei risultati nella posizione desiderata e specificare il nome del file quando richiesto. Eseguire dopo che il campione è stato iniettato nel ciclo del campione di grandi volumi. Esecuzione del metodo di purificazione Selezionare il metodo salvato e fare clic su Esegui quando richiesto dal software dello strumento (passaggio 1.2.5).NOTA: il sistema è impostato per eseguire la procedura seguente. L’utente non deve fare nulla mentre lo strumento è in esecuzione. Equilibrate la colonna con tre volumi di colonne (CV) di contattuazione equilibratione ad una portata di 2 mL/min. Una volta che la colonna è equilibrata, il sistema, utilizzando il ciclo del campione di grande volume, inietterà il campione sulla colonna ad una portata di 1 mL/min. Un calo del segnale UV a 280 nm indica che il caricamento del campione è terminato. Lavare la colonna con buffer di equilibratione ad una portata di 2 mL/min fino a quando il segnale UV scende al di sotto di 25 mAU. Utilizzare quattro CV da 25 mM Con 1 M NaCl a pH 7.5 per eseguire una lavaggio secondario ad alto sale ad una velocità di flusso di 2 mL/min. Il collettore di frazioni di sistema raccoglierà qualsiasi proteina/DNA che esce dalla colonna durante il lavaggio del sale in tubi da 50 mL. Applicare cinque CV di buffer di eluizione a una portata di 1 mL/min per eluire l’anticorpo dalla colonna. Raccogliere l’eluato in tubi da 15 mL in base al segnale UV; quando il segnale UV 280 è superiore a 35 mAU, inizia la raccolta; la raccolta termina quando il segnale scende al di sotto di 50 mAU; questo è chiamato taglio di picco.NOTA: il taglio di picco garantisce la normalizzazione dei profili di eluizione ed evitare il tailing di picco di eluizione che può contenere aggregati proteici24. Lavare la colonna utilizzando tre CV di cuscinetto per l’equilibratione. La corsa termina dopo la fase di lavaggio. Dopo l’eluizione neutralizza immediatamente la proteina purificata usando una base di 1 M Tris fino a un pH di 5,5 dollari. Misurare la concentrazione proteica utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a 280 nm e 260 nm e conservarlo a 4 gradi centigradi. Concentrare l’anticorpo purificato utilizzando unità centrifughe (passaggio 2). Quindi sottoporre l’anticorpo purificato all’analisi del glicano utilizzando LC-MS e dopo l’analisi del profilo di aggregazione utilizzando SEC-MALS (passaggi 3 e 4).NOTA: L’anticorpo purificato non deve essere congelato senza ulteriori scambi di buffer in quanto i frequenti cicli di congelamento-scongelamento possono causare aggregazione e precipitazioni. 2. Concentrazione di anticorpi purificati NOTA: Il buffer Tris-acetato è di 0,1 M di acido acetico neutralizzato con 1 M Tris Base a un pH di 5,5 dollari. Inserire 100 filtri kDa nei tubi di centrifuga. Lavare i filtri con 500 l di acqua a doppia distillazione. Centrifuga per 10 min a 14.000 x g a temperatura ambiente (RT). Ripetere questo passaggio due volte. Scartare il filtrato. Trasferire i filtri risciacquati in tubi di centrifuga freschi e aggiungere 500 l di campione ad ogni filtro. Centrifuga per 10 min a 14.000 x g. Invertire il filtro in un tubo di rotazione fresco. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g per raccogliere il campione concentrato. Determinare le concentrazioni del campione utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Svuotare lo spettrofotometro utilizzando una soluzione di buffer Tris-acetato. Utilizzare un coefficiente di estinzione delle proteine di 1,37 mL .(mg-cm)-1 a 280 nm per una soluzione IgG dell’1% (% m/v). Utilizzare il campione concentrato per preparare una soluzione di lavoro di 2 mg/mL per l’analisi del glicano e 30 di 3,5 mg/mL per sec-MALS.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni devono essere refrigerati a 4 gradi centigradi. A 2 concentrazione di mg/mL, questi campioni dovrebbero essere stabili per almeno tre mesi a 4 gradi centigradi, mentre concentrazioni più elevate potrebbero precipitare. 3. Analisi di N-glicani mediante spettroscopia di massa Etichettatura e isolamento N-Glycan Iniziare con concentrazioni di anticorpi di 2 mg/mL in un buffer appropriato come fosfato di sodio neutro, citrato o tampone HEPES. Preparare uno standard mAb intatto (come NIST mAb) a 2 mg/mL per elaborare insieme ai campioni sperimentali per servire come controllo positivo.NOTA: gli anticorpi devono trovarsi in un buffer finale che non contiene SDS e nucleofili inferiori a 0,1 mM (come Tris, DTT, glicina o istidina). SDS nel buffer di esempio deve essere rimosso. Se i nucleofili sono nel buffer, diluirli verso il basso o eseguire uno scambio di buffer in quanto interferiranno con il kit. Il protocollo generale è fornito con il kit glicano. Diluire 7,5 l degli anticorpi con 15,3 litri di acqua LC-MS-grade in tubi da 1 mL forniti con il kit e poi denaturare utilizzando una soluzione di 6 % di un surfactant enzimatico e MS-friendly a 90 gradi centigradi per 3 min. Raffreddare i campioni per 3 min a temperatura ambiente (RT). Quindi, aggiungere 1,2 l l di PNGase F e incubare per 5 min a 50 gradi centigradi. Dopo il raffreddamento da 3 min a RT, etichettare gli N-glicani slittati aggiungendo 12 -L di reagente fluorescente disciolto in anidridedidimetilformamide (DMF) e attendere 5 min. Diluire la miscela N-glicana etichettata con 358 l di acetonitle (ACN). Collocare una piastra cromatografica di interazione idrofila (HILIC) in un collettore a vuoto con shim e vassoio di scarto. Utilizzare una pipetta multicanale per un numero elevato di campioni. Condizionare i pozzi con 200 gradi di acqua, dove il vuoto è regolato in modo che il liquido ci vorrà 15-30 s per passare attraverso la resina HILIC. Prima di caricare la miscela di glicani etichettata aCcon etichettata ACN (400 l), applicando il vuoto dopo l’aggiunta di ogni nuovo liquido ai pozzi. Lavare la resina con 600 : L dell’1% di acido formica (FA)/90% ACN due volte. Sostituire il vassoio dei rifiuti con tubi da raccolta da 600. Elutare i N-glicani etichettati con tampone di eluizione SPE (3 eluzioni di 30 l ciascuna) nei tubi di raccolta. Diluire le eluzioni raggruppate con 310 – L di Diluente campione DMF/ACN. Pipette i campioni in fiale auto campionatore per essere pronti per l’analisi di fluorescenza (FLR)-MS.NOTA: Questi campioni sono stabili se conservati a -80 gradi centigradi per almeno 1 mese. Conservare la lastra HILIC nella sua confezione originale, fissata e all’interno di un desiccatore per un uso futuro. Analisi LC-MS di n-glicani etichettati Analizzare i campioni di eluizione N-glicani etichettati su un sistema di cromatografia liquida ultraperformance (UPLC) accoppiato a un rilevatore di fluorescenza e spettrometro di massa del tempo di volo quadruplicato (Q-ToF). Utilizzare una colonna omologata per la separazione cromatica dei glicani etichettati e riscaldare a 60 gradi centigradi durante le separazioni.NOTA: La colonna deve essere svuotata con il 60% acetonitrile e 40% H2O prima dell’uso: 50 CV prima del primo utilizzo o 20 CV se la colonna è stata utilizzata prima. Utilizzare il formato amilo da 50 mM (AmF) (realizzato con concentrato di fase mobile) e l’ACN 100% LC-MS-grade per le fasi mobili. L’AmF è sensibile ai cambiamenti di pH ed è utilizzabile per 1 mese dopo la miscelazione. Impostare la portata iniziale su 0,4 mL/min, con il gradiente LC che fornisce AmF crescente durante la fase di elusione. Impostare il rivelatore FLR per misurare a EX 265/EM 425 nm con una frequenza di campionamento di 2 Hz. Impostare Q-ToF sulla modalità di sensibilità iogena positiva MS1, con un intervallo di massa di 100-2.000 dalton (Da), un tempo di analisi di 0,25 secondi e un’acquisizione di dati di continuum. Utilizzare la leucina enkephalin (2 ng/L nel 50% ACN/0,1% FA) per il riferimento di massa interno, nella modalità “Non applicare la correzione”.NOTA: la correzione del riferimento di massa interno verrà applicata in un secondo momento durante l’elaborazione dei dati. Sospendere di nuovo la scala del dextran in sequenza in 22,5 gradi di H2O, 25 l di DMF e 52,5 l di ACN. Preparare 10 aliquote per lo stoccaggio a -80 gradi centigradi, in quanto la scala non è stabile per più di 24 h a temperature più elevate (temperatura ambiente, 4 gradi centigradi). La scala dextran si degrada dopo più di un ciclo di congelamento-disgelo. Collocare i campioni nel campionatore automatico impostato su 10 . Caricare una fiala della scala dextran insieme ai campioni, poiché le informazioni sul tempo di conservazione della scala verranno utilizzate per le assegnazioni mentre le informazioni di massa utilizzate per convalidare le identificazioni. Utilizzare 10 iniezioni l per i campioni e iniezioni di 7,5 ll per la scala. Iniettare campioni in triplice copia. Eseguire il metodo caricato. Identificazione N-Glycan per i dati LC-MS Eseguire l’elaborazione dei dati con un programma ottimizzato per dati di cromatometria di interazione idrofila (isromatoria di fluorescenza di massa” (HILIC-FLR-MS). Applicare correzioni di riferimento di massa interne all’interno del programma. Designare le iniezioni di scala dextran come “Standard” nelle informazioni di esempio. Nel metododi analisi , impostare i tempi di ritenzione composti di separazione su quelli dei composti ladder rilevati durante l’esecuzione. Per assicurarsi che la % dell’area venga restituita per i glicani identificati, modificare il Metodo di analisi: nella scheda Elaborazione, fare clic su Impostazioni di quantificazione – Calibrare e impostare “Tipo di adattamento della curva di calibrazione” su “Risposta relativa (%)”. 4. Analisi dell’aggregazione di anticorpi mediante SEC-MALS Preparazione del campione Trasferire la proteina diluita da 3,5 mg/mL (passaggio 2) su una fiala con un inserto in vetro da 150 . Utilizzare una punta di caricamento gel per pipet nella campana inferiore dell’inserto per evitare l’introduzione di bolle. Capovolga la fiala con un cappuccio setta e analizza subito. Conservare a 4 gradi centigradi se si analizzano in un secondo momento. Configurazione ed equilibratore SEC-MALSNOTA: analizzare l’aggregazione su SEC-MALS configurato con una cromatografia liquida ad altissima pressione (UHPLC) con un rilevatore di indice MALS e un rilevatore di indici refrattivi controllati dal software MALS. Configurare un file di metodo nel software UHPLC per il controllo del sistema UHPLC, impostando la portata a 0,4 mL/min con una fase mobile di 1x Fosfato Buffered Saline (PBS) (diluito da 10x), il volume di iniezione a 5 e il rilevatore di array Diode (DAD) per monitorare 280 nm. Impostare il tempo di esecuzione su 20 min. L’interfaccia tra i rilevatori UHPLC e Multi Angle Light Scattering – Refractive Index (MALS-RI) richiede l’uso dell’uscita analogica sul DAD. Impostare l’attenuazione DAD su 1.000 mAU nel file del metodo DAD e l’impostazione AU/UV su 1 (strumentoUV>Channels>Channel 1). Accendere la lampada DAD 30 min prima di iniziare l’analisi e impostare la lunghezza d’onda su 280 nm. Allo stesso tempo, eliminare la cella di riferimento Refractive Index (RI) per 15 min o fino a quando la linea di base è stabile e quindi chiudere la cella di riferimento. Configurare la sequenza software SEC-MALS, impostando il tempo di raccolta a 12 min, il volume di iniezione a 5, il dn/dc a 0,185 mL/g, il coefficiente di estinzione A280 se precedentemente determinato sperimentalmente o a 1,37 mL campione. Fare clic su Esegui e attendere che venga visualizzata la finestra di dialogo “in attesa di inserimento”.NOTA: Il coefficiente di estinzione A280 è specifico per la proteina di interesse e deve essere determinato sperimentalmente. Configurare un elenco di esempio nel software UHPLC nello stesso ordine del software MALS-RI e inviarlo.NOTA: è importante eseguire un controllo di idoneità del sistema prima e dopo una corsa. L’albumina del siero bovino viene in genere utilizzata per verificare l’ampliamento dei picchi, segno che la colonna SEC potrebbe aver bisogno di pulizia o sostituzione. La stessa iniezione standard BSA può essere utilizzata per specificare l’allineamento del segnale, l’ampliamento del picco e la normalizzazione del rilevatore. Analisi aggregata con il software MALS Fare clic sulla scheda Procedure. Specificare il livello minimo di sblocco richiesto; di solito nessuno è sufficiente. Verificare che le linee di base siano state disegnate correttamente e regolate se necessario, per i canali LS1, LS2, LS3, RI e UV. Impostare l’area di picco di interesse. Rivedere la distribuzione di massa molecolare per confermare che i picchi chiamati contengono particelle di dimensioni simili. 5. Analisi delle varianti di carica Preparazione ed etichettatura dei campioni Iniziare con 80 – L di una soluzione anticorpale 3,5 mg/mL. Desalare il campione utilizzando una colonna di dissalamento di 0,5 mL (7k MWCO). Preparare la colonna prima scattando il tappo inferiore, poi allentando il tappo superiore e posizionandolo in un tubo di microcentrismo da 1,7 mL. Centrifugare la colonna di salsalina per 1 min a 1.500 x g.NOTA: Contrassegnare l’esterno della colonna con un punto in modo che possa essere posizionato nell’orientamento originale per i passaggi successivi. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di microcentrismo. Aggiungere l’80 l di proteine diluite nella parte superiore della colonna. Allineare la colonna all’orientamento originale. Centrifuga per 2 min a 1.500 x g. Togliere il campione dalla centrifuga, scartare la colonna di dealanding e mescolare bene il campione.NOTA: Il dealfiore è necessario solo se la matrice del campione contiene ammine primarie, eccipienti che perturberanno l’elettroforesi del campione o altre sostanze incompatibili. Diluire il campione fino a una concentrazione finale di 2 mg/mL in un volume di 25 ,l e aggiungere 5 l del tampone di etichettatura (vedere Tabella dei materiali: Kit ReagenteVariante Carica ) nella piastra del pozzo 96. Preparare il reagente di etichettatura diluindo la quantità necessaria di reagente di etichettatura (vedere Tabella dei materiali: Charge Variant Reagent Kit) 1:30 in dimetilformamide. Incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente lontano dalla luce.NOTA: È importante scongelare e quindi utilizzare immediatamente questo reagente e utilizzarlo entro 10 min di miscelazione con DMF. Dopo l’incubazione, aggiungere 60 -L di acqua di grado reagente e mescolare bene pipettando. Coprire la piastra con un sigillo a piastra e centrifugare la piastra a 1.000 x g per 1 min. Preparazione del chip della variante di carica Preparare il chip Charge Variant rimuovendo la soluzione di stoccaggio e lavando i pozzi 1, 3, 4, 7, 8 e 10 con acqua. Quindi sostituire l’acqua con il buffer di corsa pH 7.2 (vedere Tabella dei materiali: Charge Variant Reagent Kit). Aggiungete 750 l di pH 7.2 nel tubo tampone e posizionate il tubo tampone nell’angolo superiore sinistro del vassoio campione. Ora rimuovere la guargono della piastra dalla piastra del pozzo 96, premere Scarica piastra sull’interfaccia utente dello strumento e inserire la piastra nel vassoio del campione GXII.NOTA: per questa analisi sono stati utilizzati buffer pH 7.2. a seconda della proteina pI possono essere utilizzati tamponi 5,6-7,2. Quando si utilizzano buffer pH inferiori, potrebbero essere necessari tempi di esecuzione dei campioni più lunghi. Premere il pulsante Scarica chip nell’interfaccia utente. Assicurarsi che gli elettrodi siano privi di particelle e, in caso contrario, pulire con un tampone privo di lani. Quando si inserisce il chip assicurarsi che la finestra al centro del chip sia priva di particelle o macchie. Se necessario, pulire con un panno morbido senza laminetta.NOTA: Quando si lavora con chip di elettroforesi capillare, rimuovere il tampone dall’aspirazione del vuoto, seguito dall’aggiunta immediata della soluzione successiva per evitare che i pozzi si asciughino. Per ridurre al minimo l’introduzione di bolle, praticare la tecnica di reverse pipetting. Quando si maneggia il chip, tenere presente il fragile capillare che si estende dal fondo del chip, assicurandosi che non si asciughi e non scompaia attraverso la manipolazione ruvida. Chiudere il coperchio alla camera del chip e selezionare il saggio HT Protein Charge Variant. Fare clic sul pulsante Esegui. Seguire le istruzioni visualizzate per selezionare i pozzi di esempio, il tipo di piastra, l’ora di prova (68, 90 o 100 s) e il nome del file. Fare clic su Inizia alla fine delle richieste. La pulizia dei trucioli richiede il lavaggio di ogni pozzo 2x con acqua, seguita dall’aggiunta di Storage Buffer (vedere Tabella dei materiali: Charge Variant Reagent Kit). Una volta nel buffer di stoccaggio, sostituire il chip nello strumento e, quando richiesto, selezionare il saggio HT Protein Charge. Nella schermata principale selezionare Lavaggio nell’interfaccia utente. Una volta completato, rimuovere il chip, pulire gli elettrodi con acqua e un tampone senza lafo, e conservare il chip a 4 gradi centigradi. Analisi delle varianti di addebito Aprire il software di analisi dello strumento. Importare l’esecuzione scegliendo File>Importa file didati… e facendo clic sul file .gxd desiderato. Solo il nome verrà riportato al software, quindi la ridenominazione dei pozzi è vantaggiosa (Strumenti > Editor nomi di esempio). Selezionare i file da esportare tenendo premuto MAIUSC mentre si selezionano i file. Fare clic su File>Esporta… e selezionare la casella Dati non elaborati e quindi la casella Formato AIA. Aprire la scheda Sfoglia progetti all’interno del software di analisi. Fare clic su Database>Importa dati… e selezionare il file esportato. CDF. Una volta importato, vai alla scheda Iniezioni, seleziona i file da analizzare, fai clic con il pulsante destro del mouse e vai a Processo… Nella finestra visualizzata, selezionare la casella di controllo accanto a Processo e selezionare la casella di opzione “Usa metodo di elaborazione specificato” e il metodo di elaborazione desiderato dalla casella di riepilogo a discesa. Nella casella a discesa immediatamente sotto l’etichetta “Come:” selezionare Calibra toscarica e Quantitate. Una volta elaborati, passare alla scheda Risultati e controllare l’integrazione dei cromatogrammi.NOTA: il metodo di elaborazione deve essere verificato per ogni metodo. Come punto di partenza, i parametri utilizzati per il metodo di elaborazione corrente sono inclusi nel file supplementare.NOTA: l’esportazione dei dati può essere eseguita sotto forma di report o solo la quantificazione di picco può essere esportata. Questi possono essere eseguiti nello stesso momento dell’elaborazione o dalla finestra dei risultati. 6. Analisi degli amminoacidi Impostazione della curva standard per la quantificazione assoluta degli amminoacidi da parte di LC-MS Preparare la miscela di aminoacidi estesi (EAA) sciogliendo 59,45 mg di Asn, 59,00 mg di Hyp, 65,77 mg di Gln e 91,95 mg di Trp in 25 mL di 0,1 N HCl. La concentrazione finale di ogni amminoacido nella miscela EAA è di 18 nmol/L. Preparare la soluzione di stock standard interno (IsTD) sciogliendo 58.58 mg di Nva e 44.54 mg di Sar in 50 mL di HCl. Preparare gli standard completi degli amminoacidi combinando la soluzione di stock di amminoacidi contenente Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val a 1 nmol/ , 225, 90, 22,5 e 9 pmol/L. Aggiungere lo stock ISTD preparato agli standard di amminoacidi per una concentrazione finale di 90 pmol/l o 900 pmol/l per creare standard interni “bassi” e “alti” da utilizzare come controlli positivi per il metodo. Collocare le concentrazioni di amminoacidi nelle fiale campione nell’autocampionatore dell’UPLC. Generare una curva di calibrazione (da 9 a 900 pmol/ ) nel software dello strumento in base alle concentrazioni standard di amminoacidi utilizzando le seguenti istruzioni. Utilizzare il Q-ToF in modalità di sensibilità positiva ESI (Electrospray ionizzazione) accoppiato a un UPLC per un’analisi intatta degli amminoacidi. Per la separazione cromatografica, utilizzare una colonna di fase normale fatta per le separazioni di aminoacidi. Preparare i seguenti buffer con reagenti di grado di spettrometria di massa: A – acetonitrile – 0,1% di acido formico e B – 100 mM formato di ammonio. Impostare la portata LC su 0,6 mL/min e la temperatura della colonna su 40 gradi centigradi. Utilizzare le seguenti condizioni di gradiente di 15 minuti per le separazioni degli amminoacidi: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min). Utilizzare gli elenchi delle colonne “Tipo campione” e “Conc A” nel programma di acquisizione MS per creare una curva di calibrazione per l’analisi futura dei supporti bioreattori grezzi nel programma di quantificazione. Per fare in modo che queste colonne vengano visualizzate nel programma di acquisizione, utilizzare il comando Personalizza visualizzazione… quando si fa clic con il pulsante destro del mouse sulla barra dei menu superiore. Il tipo di campione per gli standard di amminoacidi sarà “Standard”, mentre i campioni multimediali saranno “Analita”. Compilare la colonna “Conc A” con le concentrazioni numeriche degli standard nelle unità richieste (ad es. pmol/L). Eseguire le concentrazioni standard di amminoacido preparate almeno due volte. Verificare che lo strumento UPLC e lo spettrometro di massa funzionino correttamente controllando i picchi ISTD. Utilizzare l’opzione “Modifica metodo” nell’applicazione di quantificazione per creare il metodo di quantificazione (file con estensione mdb). Definire tutti gli aminoacidi di interesse nell’applicazione di quantificazione, ad esempio il nome composto, il valore m/z e il tempo di conservazione previsto. Modificare qui i parametri di integrazione per il metodo. Utilizzare il metodo dell’amminoacido creato sui campioni standard per creare la curva di calibrazione. Questa curva può essere esportata in un file cdb per l’uso con gli esempi multimediali utilizzando il comando Esporta>Calibrazione…. Nell’applicazione di quantificazione, salvare il layout desiderato in un file con estensione qlt da applicare ai set di dati futuri utilizzando “Salva layout con nome…”. Nome (nome iniezione), Area e Conc sono le colonne di output più importanti. Analisi degli amminoacidi dei supporti bioreattori grezzi da parte di LC-MS Centrifuga supporti bioreattori grezzi a 1.962 x g per 5 minuti e passare attraverso un filtro di 0,22 m. Seguire con una pulizia dell’acido perclororico per rimuovere proteine e particolato: mescolare il supporto filtrato bioreattore con 0.4 N HClO4 a un rapporto 1:1 e centrifugare a 14.700 x g per 5 min a RT. Raccogliere il supporto chiarificato in fiale autocampionatore.NOTA: Regolare il volume di iniezione in base alle esigenze per far rientrare nell’intervallo di calibrazione le concentrazioni di amminoacidi. A seconda dello strumento, il volume di iniezione può essere regolato tra 0,1 e 10 l. Eseguire campioni multimediali in triplice copia di LC-MS. Utilizzare “Process Samples” nel programma di quantificazione insieme al metodo (con estensione mdb) e al file di calibrazione (con estensione cdb). Il metodo e la curva di calibrazione verranno applicati automaticamente ai campioni di supporti grezzi mediante l’applicazione di quantificazione una volta completate tutte le iniezioni. Per esportare i dati per l’analisi in un altro programma (ad esempio un foglio di calcolo), utilizzare il comando “Stampa” e creare un file con estensione xps o pdf.