Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

1. purificação do anticorpo Nota: o tampão de equilíbrio para o anticorpo em casa é 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. O tampão de eluição utilizado é de 0,1 M de ácido acético. Os tampões e a resina (proteína A) são dependentes do anticorpo específico purified. O volume da coluna é equivalente à altura da cama da resina. A quantidade de fase móvel usada é determinada em termos de volume de coluna. Inicializando o sistema de purificação Abra o software anexado ao sistema de purificação. Utilizando instruções manuais, equilibrar a coluna com o tampão de equilíbrio a uma vazão de 2 mL/min para 40 min. pare o funcionamento manual após a equilibração. No coletor de fração, coloque 15 mL de tubos cônicos para coletar o eluato de anticorpos purificados e 50 mL de tubos cônicos para coletar fluxo durante a alta lavagem de sal. Certifique-se de que o coletor de fração seja redefinido para a posição inicial abrindo e fechando o coletor de fração antes do início da execução. O coletor de fração é mantido a 7 ° c.Observação: o coletor de fração pode ser redefinido manualmente na guia coletor de fração em configurações, para tubos de 15 ml e 50 ml. Injeção da amostraNota: o fluido de cultura de células colhidas utilizado nos seguintes procedimentos foi obtido a partir de células de ovário de hamster chinês cultivadas em microbiorreatores automatizados9. Adicione o fluido de cultura de células de colheita filtrada a 0,22 μm a uma seringa vazia de 12 mL cuja extremidade do bocal esteja tampada. Segurando a seringa com o bocal virado para baixo, insira o êmbolo da seringa até que uma pequena porção do êmbolo esteja. Certificando-se de que o fluido não está vazando, gire a seringa com o bocal voltado para cima e retire a tampa. Ainda segurando a seringa com o bico virado para cima, empurre o cilindro para dissipar qualquer ar até que o fluido de cultura celular esteja na ponta do bico. Insira o bocal da seringa na porta de injecção manual do sistema de purificação e gire para apertar. Empurre para baixo no êmbolo até que toda a amostra seja injetada e seja visível no loop de amostra de 10 mL em anexo de grande volume. Abra o arquivo de método salvo. Salve o arquivo de resultado no local necessário e especifique o nome do arquivo quando solicitado. Hit executar depois que o exemplo foi injetado no loop de amostra de grande volume. Executando o método de purificação Selecione o método salvo e clique em executar quando solicitado pelo software do instrumento (etapa 1.2.5).Nota: o sistema está configurado para executar os seguintes passos. O usuário não precisa fazer nada enquanto o instrumento está em execução. Equilibrar a coluna com três volumes de coluna (CVs) de tampão de equilibração a uma vazão de 2 mL/min. Uma vez que a coluna é equilibrada, o sistema, usando o loop de amostra de grande volume, injetará a amostra na coluna a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Uma gota no sinal UV em 280 nanômetro indica que a amostra está carregando terminado. Lave a coluna com tampão de equilíbrio a uma vazão de 2 mL/min até que o sinal UV caia abaixo de 25 mAU. Use quatro CVs de 25 milímetros Tris com 1 M NaCl em pH 7,5 para executar uma lavagem de sal elevada secundária em uma taxa de fluxo de 2 mL/min. O coletor de fração do sistema coletará qualquer proteína/DNA que sai da coluna durante a lavagem de sal em tubos de 50 mL. Aplique cinco CVS do tampão da eluição em uma taxa de fluxo de 1 ml/min para Eluir o anticorpo fora da coluna. Recolha o eluato em tubos de 15 mL com base no sinal UV; Quando o sinal UV 280 está acima de 35 mAU, a coleção começa; a coleção termina quando o sinal cai abaixo de 50 mAU; Isso é chamado de corte de pico.Nota: o corte de pico assegura a normalização dos perfis de eluição e evita o pico de eluição que pode conter agregados proteicos24. Lave a coluna utilizando três CVs de tampão de equilibração. A corrida termina após a etapa de lavagem. Após a eluição, neutralizar imediatamente a proteína purificada utilizando a base Tris de 1 M para um pH de ~ 5,5. Meça a concentração da proteína usando um espectrofotômetro UV-Vis do microespectrômetro em 280 nanômetro e em 260 nanômetro e armazene em 4 ° c. Concentre o anticorpo purificado utilizando unidades centrífugas (passo 2). Em seguida, sujeitar o anticorpo purificado à análise de glicanos utilizando LC-MS e analisar o perfil de agregação usando SEC-MALS (etapas 3 & 4).Nota: o anticorpo purificado não deve ser congelado sem mais trocas de tampão, uma vezes que os ciclos de congelamento-degelo frequentes podem causar agregação e precipitação. 2. concentração de anticorpos purificados Nota: o tampão Tris-Acetato é de 0,1 M de ácido acético neutralizado com 1 M Tris base a um pH de ~ 5,5. Insira 100 filtros kDa em tubos de centrifugação. Lave os filtros com 500 μL de água destilada dupla. Centrifugador por 10 min a 14.000 x g à temperatura ambiente (RT). Repita este passo duas vezes. Descarte o filtrado. Transfira os filtros enxaguados para tubos de centrifugação frescos e adicione 500 μL de amostra a cada filtro. Centrifugador por 10 min a 14.000 x g. Inverta o filtro em um tubo de giro fresco. Centrifugue por 2 min a 1.000 x g para recolher a amostra concentrada. Determine as concentrações da amostra usando um espectrofotômetro UV-VIS. Em branco o espectrofotômetro usando uma solução de tampão do Tris-Acetato. Use um coeficiente de extinção de proteínas de 1,37 mL • (mg • cm)-1 a 280 nm para uma solução de IgG de 1% (% m/v). Use a amostra concentrada para preparar 12,5 μL de solução de trabalho de 2 mg/mL para análise de glicanos e 30 μL de 3,5 mg/mL de solução de trabalho para SEC-MALS.Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. As amostras devem ser refrigeradas a 4 ° c. Na concentração de 2 mg/mL, estas amostras devem ser estáveis durante pelo menos três meses a 4 ° c, enquanto as concentrações mais elevadas podem precipar-se. 3. análise de N-glycans utilizando espectroscopia de massa Rotulagem e isolamento de N-glycan Comece com concentrações de anticorpos de 2 mg/mL num tampão adequado, como fosfato de sódio neutro, citrato ou tampão HEPES. Prepare um padrão de mAb intacto (como o NIST mAb) em 2 mg/mL para processar ao lado das amostras experimentais para servir como um controle positivo.Nota: os anticorpos devem estar em um tampão final contendo não SDS e menos de 0,1 mM nucleófilos (como Tris, DTT, glicina ou histidina). SDS no buffer de exemplo deve ser removido. Se os nucleófilos estão no buffer, em seguida, dilui-los ou executar uma troca de buffer, uma vez que irá interferir com o kit. O protocolo geral é fornecido com o kit glicana. Diluir 7,5 μL dos anticorpos com 15,3 μL de água LC-MS-grade em tubos de 1 mL fornecidos com o kit e, em seguida, desnaturar utilizando 6 μL de solução a 5% de um surfactante amigável à enzima e MS-friendly a 90 ° c durante 3 min. Arrefecer as amostras durante 3 minutos até à temperatura ambiente (RT). Em seguida, adicione 1,2 μL de PNGase F e incubar por 5 min a 50 ° c. Após refrigerar 3 min a RT, Rotule os n-glycans clivados adicionando 12 μl do reagente de marcação fluorescente dissolvido em dimetilformamida anidro (Dmf) e aguarde 5 min. diluir a mistura de n-glycan rotulada com 358 μL de acetonitrila (ACN). Coloque uma placa de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) em um colector de vácuo com calços e bandeja de resíduos. Use uma pipeta multicanal para um grande número de amostras. Condicionar os poços com 200 μL de água, onde o vácuo é ajustado de modo que o líquido tomará 15-30 s para passar através da resina HILIC. Equilibrar com 200 μL de 85% da ACN antes de carregar a mistura de glicana rotulada pela ACN (400 μL), aplicando o aspirador após cada novo líquido ser adicionado aos poços. Lave a resina com 600 μL de 1% de ácido fórmico (FA)/90% de ACN duas vezes. Substitua a bandeja de resíduos por tubos de coleta de 600 μL. Elute o N-glycans etiquetado com tampão da eluição do SPE (3 elutions de 30 μL cada) nos tubos da coleção. Diluir as eluções agrupadas com 310 μL de diluente da amostra DMF/ACN. Pipeta as amostras em frascos de amostrador automático para estar pronto para análise de fluorescência (FLR)-MS.Nota: estas amostras são estáveis quando armazenadas a-80 ° c durante pelo menos 1 mês. Guarde a placa HILIC na sua embalagem original, gravada fechada e dentro de um dessecador para uso futuro. Análise LC-MS de N-glycans rotulados Analise as amostras de eluição de N-glycan rotuladas em um sistema de cromatografia líquida de ultra desempenho (UPLC) acoplado a um espectrómetro de massa de tempo de voo (Q-ToF) de detector de fluorescência e quadrupolo. Use uma coluna aprovada para a separação cromatográfica dos glicanos etiquetados e aqueça-o ao ° c 60 durante separações.Nota: a coluna deve ser lavada com 60% de acetonitrila e 40% H2o antes de usar: 50 CVS antes do primeiro uso ou 20 CVS se a coluna tiver sido usada antes. Use 50 mM de amônio (AmF) (feito com concentrado de fase móvel) e 100% LC-MS-grade ACN para as fases móveis. O AmF é sensível às mudanças do pH e é utilizável por 1 mês após a mistura. Ajuste a taxa de fluxo inicial a 0,4 mL/min, com o inclinação do LC que fornece o AmF crescente durante a fase da eluição. Defina o detector FLR para medir no EX 265/EM 425 nm com uma taxa de amostragem de 2 Hz. defina o Q-ToF para o modo de sensibilidade de íon positivo MS1, com uma faixa de massa de 100-2000 Daltons (da), um tempo de digitalização de 0,25 segundos e aquisição de dados contínuos. Use a encefalina de leucina (2 ng/μl em 50% ACN/0.1% FA) para a referência de massa interna, no modo “não aplicar correção”.Observação: a correção de referência de massa interna será aplicada posteriormente durante o processamento de dados. Re-suspender a escada de dextrano sequencialmente em 22,5 μL de H2O, 25 ΜL de DMF e 52,5 ΜL de ACN. Prepare alíquotas de 10 μL para armazenamento a-80 ° c, pois a escada não é estável por mais de 24 h a temperaturas mais elevadas (temperatura ambiente, 4 ° c). A escada de dextrano degrada-se após mais de um ciclo do congelar-thaw. Coloque as amostras no amostrador automático definido para 10 ° c. Carregue um frasco da escada do dextrano junto com amostras, porque a informação do tempo de retenção da escada será usada para atribuições quando a informação maciça usada para validar identificações. Use injeções de 10 μL para as amostras e injeções de 7,5 μL para a escada. Injectar amostras em triplicado. Execute o método carregado. Identificação de N-glycan para dados LC-MS Realizar o processamento de dados com um programa otimizado para cromatografia de interação hidrofílica espectrometria de massas de fluorescência (HILIC-FLR-MS). Aplique correções de referência de massa interna dentro do programa. Designe as injeções da escada do dextrano como o “padrão” na informação da amostra. No método de análise, defina os tempos de retenção do composto de separação para os compostos de escada que foram detectados durante a execução. Para garantir que a área% será devolvida para os glicanos identificados, modifique o método de análise: na guia processamento , clique em configurações de quantitation -calibrar e definir “tipo de ajuste da curva de calibração” para “resposta relativa (%)”. 4. análise da agregação de anticorpos utilizando SEC-MALS Preparação da amostra Transfira a proteína diluída 3,5 mg/mL (passo 2) para um frasco para injetáveis com uma pastilha de vidro de 150 μL. Use uma ponta do carregamento do gel ao Pipet no sino inferior da inserção para evitar a introdução de bolhas. Tampe o frasco com uma tampa de septos e analise imediatamente. Armazene a 4 ° c se analisar mais tarde. Configuração e equilibração SEC-MALSNota: analise a agregação em SEC-MALS configurada com uma cromatografia líquida ultra de alta pressão (UHPLC) com um detetor de MALS e um detector de índice refractive controlados pelo software de MALS. Configurar um arquivo do método no software de UHPLC para o controle do sistema de UHPLC, ajustando a taxa de fluxo a 0,4 mL/min com uma fase móvel de 1x fosfato tamponado Saline (PBS) (diluído de 10x), o volume da injeção a 5 μL, a temperatura da coluna a 25 ° c e o detector de matriz de diodos (DAD) para monitorizar 280 nm. Definir o tempo de execução para 20 min. equilibrar o sistema por pelo menos 4 h antes de qualquer análise da amostra. A interface entre os detectores UHPLC e Multi Angle Light Scattering-refractive index (MALS-RI) requer o uso da saída analógica no DAD. Defina a atenuação DAD para 1.000 mAU no arquivo de método DAD e AU/UV configuração para 1 (UV instrumento ≫ Channels ≫ Channel 1). Ligue a lâmpada DAD 30 min antes da análise inicial e defina o comprimento de onda para 280 nm. Ao mesmo tempo, limpe a célula de referência do índice de refração (RI) por 15 min ou até que a linha de base seja estável e feche a célula de referência. Configure a sequência de software SEC-MALS, definindo o tempo de coleta para 12 min, o volume de injeção para 5 μL, o DN/DC para 0,185 mL/g, coeficiente de extinção A280 se previamente determinado experimentalmente ou para 1,37 mL * (mg * cm)-1, e a concentração do Amostra. Clique em executar e aguarde até que a caixa de diálogo “aguardando para injetar” apareça na tela.Nota: o coeficiente de extinção A280 é específico para a proteína de interesse e deve ser determinado experimentalmente. Configure uma lista de exemplo no software UHPLC na mesma ordem que no software MALS-RI e envie.Nota: é importante executar uma verificação de adequação do sistema antes e depois de uma execução. A albumina sérica bovina normalmente é usada para verificar a ampliação do pico, um sinal de que a coluna da SEC pode precisar de limpeza ou substituição. A mesma injeção padrão de BSA pode ser usada para especificar o alinhamento do sinal, o pico de ampliação e a normalização do detector. Análise agregada com software MALS Clique no separador procedimentosmarcados. Especifique o nível mínimo de desprezo exigido; nenhum é geralmente suficiente. Verifique se as linhas de base foram desenhadas corretamente e ajuste se necessário, para canais LS1, LS2, LS3, RI e UV. Defina a área de pico de interesse. Revise a distribuição de massa molecular para confirmar que os picos chamados contêm partículas de tamanho semelhante. 5. análise de variantes de carga Preparação e rotulagem da amostra Comece com 80 μL de uma solução de anticorpo 3,5 mg/mL. Desalt a amostra usando uma coluna de Dessalinagem de 0,5 mL (7K MWCO). Prepare a coluna primeiro tirando a tampa inferior, em seguida, afrouxando a rolha superior, e colocando-o em um tubo de micro-centrífuga 1,7 mL. Centrifugue a coluna de dessalinagem durante 1 min a 1.500 x g.Observação: marque o exterior da coluna com um ponto para que ele possa ser colocado na orientação original para as próximas etapas. Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione o 80 μL de proteína diluída na parte superior da coluna. Alinhe a coluna à orientação original. Centrifugador por 2 min a 1.500 x g. Retire a amostra da centrífuga, descarte a coluna de dessalinagem e misture bem a amostra.Nota: a Dessalinagem só é necessária se a matriz da amostra contiver aminas primárias, excipientes que perturbarão a electroforese da amostra ou outras substâncias incompatíveis. Diluir a amostra para uma concentração final de 2 mg/mL num volume de 25 μL e adicionar 5 μL do tampão de rotulagem (ver tabela de materiais: kit de reagentes de variante de carga) na placa de 96 poços. Prepare o reagente de rotulagem diluindo a quantidade necessária de reagente de rotulagem (ver tabela de materiais: kit de reagente variante de carga) 1:30 em dimetilformamida. Incubar a amostra por 10 min à temperatura ambiente longe da luz.Nota: é importante descongelar e, em seguida, utilizar imediatamente este reagente e utilizá-lo dentro de 10 min de mistura com DMF. Após a incubação, adicione 60 μL de água de grau de reagente e misture bem com pipetagem. Cubra a placa com um selo da placa e centrifugue a placa em 1.000 x g por 1 minuto. Preparando o chip variante de carga Prepare o chip Variant Charge removendo a solução de armazenamento e lavando os poços 1, 3, 4, 7, 8 e 10 com água. Em seguida, substitua a água por pH 7,2 em execução (ver tabela de materiais: kit de reagentes de variante de carga). Adicione 750 μL de pH 7,2 que executam o tampão ao tubo do amortecedor e coloc o tubo do amortecedor no ponto indicado no canto esquerdo superior da bandeja da amostra. Agora remova o selo da placa da placa 96-well, pressione a placa do descarregamento na interface de usuário do instrumento, e introduza a placa na bandeja da amostra de gxii.Nota: foram utilizados buffers de pH 7,2 para esta análise. os tampões do pH 5.6-7.2 podem ser usados dependendo da proteína pI. Ao usar buffers de pH inferiores, tempos de execução de amostra mais longos podem ser necessários. Pressione o botão descarregar chip na interface do usuário. Assegure-se de que os eléctrodos estão livres de quaisquer partículas e, se não, limpe com um cotonete sem fiapos. Ao inserir a microplaqueta certifique-se de que a janela no centro da microplaqueta está livre das partículas ou dos borrões. Se necessário, limpe com um pano macio sem fiapos.Nota: ao trabalhar com chips de eletroforese capilar, remova o tampão por aspiração a vácuo, seguido pela adição imediata da próxima solução para evitar que os poços SECem. Para minimizar a introdução de bolhas, pratique a técnica de pipetagem reversa. Ao manusear o chip, esteja atento ao capilar frágil que se estende da parte inferior do chip, certificando-se de que ele não seque e não quebre a manipulação áspera. Feche a tampa da câmara de chip e selecione o ensaio de variante de carga de proteína HT . Clique no botão executar . Siga as instruções para selecionar os poços de amostra, o tipo de placa, o tempo de ensaio (68, 90 ou 100 s) e o nome do arquivo. Clique em Iniciar no final dos prompts. A limpeza de cavacos requer a lavagem de cada poço 2x com água, seguida da adição de buffer de armazenamento (vide tabela de materiais: kit de reagentes de variante de carga). Uma vez no buffer de armazenamento, substitua o chip no instrumento e, quando solicitado, selecione o ensaio de carga de proteína HT. Na tela principal, selecione Wash na interface do usuário. Uma vez terminado, retire o chip, limpe os eléctrodos com água e um cotonete sem fiapos e guarde o chip a 4 ° c. Análise de variantes de carga Abra o software de análise de instrumentos. Importe a execução indo para arquivo ≫ Importar arquivo de dados… e clicando no arquivo *. gxd desejado. Somente o nome será transportado para o software, então renomear os poços é vantajoso (ferramentas ≫ editor de nome de exemplo). Selecione os arquivos a serem exportados mantendo pressionada a tecla Shift enquanto seleciona os arquivos. Clique em arquivo ≫ exportar… e selecione a caixa de dados RAW e, em seguida, a caixa de formato AIA . Abra a guia procurar projetos dentro do software de análise. Clique em banco de dados ≫ importar dados… e selecione o exportado *. Arquivos CDF. Uma vez importado, navegue até a guia injeções , selecione os arquivos a serem analisados, clique com o botão direito e vá para o processo… Na janela que aparece, marque a caixa de seleção ao lado de processar e selecione a caixa de rádio “usar método de processamento especificado” e o método de processamento desejado na caixa suspensa. Na caixa suspensa imediatamente abaixo rotulada “como:” Selecione calibrar e Quantitate. Uma vez processado, navegue até a guia resultados e verifique a integração dos cromatogramas.Observação: o método de processamento precisa ser verificado para cada método. Como ponto de partida, os parâmetros usados para o método de processamento atual são incluídos no arquivo suplementar.Nota: a exportação dos dados pode ser feita a forma de um relatório ou somente a quantificação máxima pode ser exportada. Eles podem ser feitos ao mesmo tempo que o processamento ou a partir da janela de resultados. 6. análise do aminoácido Configurando a curva padrão para a quantificação absoluta do aminoácido por LC-MS Prepare a mistura de aminoácido estendido (EAA) dissolvendo 59,45 mg de ASN, 59, 0 mg de Hyp, 65,77 mg de GLN e 91,95 mg de TRP em 25 mL de 0,1 N HCl. A concentração final de cada aminoácido na mistura de EAA é de 18 nmol/μL. Prepare a solução de estoque padrão interno (ISTD) dissolvendo 58,58 mg de NVA e 44,54 mg de SAR em 50 mL de HCl. Prepare os padrões de aminoácidos completos combinando a solução de aminoácidos contendo ala, ASP, arg, Cys, glu, Gly, his, Ile, leu, Met, Phe, pro, ser, thr, TRP, Tyr, Val em 1 nmol/μL cada uma com a mistura de EAA para concentrações de aminoácidos finais de 900 , 225, 90, 22,5 e 9 pmol/μL. Adicione o estoque de ISTD preparado às normas de aminoácidos para uma concentração final de 90 pmol/μL ou 900 pmol/μL para criar padrões internos “Baixos” e “altos” para usar como controles positivos para o método. Coloque as concentrações de aminoácidos em frascos de amostra no amostrador automático do UPLC. Gere uma curva de calibração (9 a 900 pmol/μL) no software do instrumento com base nas concentrações padrão de aminoácidos utilizando as seguintes instruções. Use o Q-ToF no modo de sensibilidade positiva de ionização por electrospray (ESI) acoplado a um UPLC para análise de aminoácidos intactos. Para a separação cromatográfica, use uma coluna normal da fase feita para separações do ácido aminado. Prepare os seguintes buffers com reagentes de classe de espectrometria de massa: A = acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico e B = 100 mM de amônio formate. Defina a vazão LC para 0,6 mL/min e a temperatura da coluna para 40 ° c. Use as seguintes condições de gradiente de 15 minutos para separações de aminoácidos: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min). Use as listagens de coluna “tipo de amostra” e “conc A” no programa de aquisição MS para criar uma curva de calibração para análise futura de mídia de biorreator bruto no programa de quantificação. Para fazer essas colunas aparecerem no programa de aquisição, use o comando Personalizar exibição… quando clicar com o botão direito do mouse na barra de menu superior. O tipo de amostra para os padrões de aminoácidos será “padrão”, enquanto as amostras de mídia será “analyte”. Preencha a coluna “conc A” com as concentrações numéricas das normas nas unidades requeridas (ex: pmol/μL). Execute as concentrações padrão de aminoácidos preparados pelo menos duas vezes. Valide que o instrumento de UPLC e o espectrómetro maciço estão trabalhando corretamente verific os picos de ISTD. Use a opção “Editar método” no aplicativo de quantificação para criar o método de quantificação (arquivo *. mdb). Defina todos os aminoácidos de interesse na aplicação de quantificação, como o nome composto, o valor de m/z e o tempo de retenção esperado. Altere os parâmetros de integração para o método aqui. Use o método de aminoácido criado nas amostras padrão para criar a curva de calibração. Essa curva pode ser exportada para um arquivo *. CDB para uso com as amostras de mídia usando o comando Export ≫ Calibration… . No aplicativo de quantificação, salve o layout desejado em um arquivo *. QLT para aplicar a conjuntos de dados futuros usando “salvar layout como…”. Nome (nome da injeção), área e conc são as colunas de saída mais importantes. Análise de aminoácidos de meios de biorreator brutos por LC-MS Centrifugue a mídia bruta de biorreator em 1.962 x g por 5 minutos e passe por um filtro de 0,22 μm. Acompanhamento com uma limpeza de ácido perclórico para remover proteínas e partículas: misture os meios de biorreator filtrados com 0,4 N HClO4 a uma proporção de 1:1 e centrifugador a 14.700 x g por 5 min em RT. colete os meios esclarecidos em frascos para injetáveis do amostrador automático.Nota: ajuste o volume de injeção conforme necessário para que as concentrações de aminoácidos caiam dentro da faixa de calibração. Dependendo do instrumento, o volume de injeção pode ser ajustado entre 0,1 μL e 10 μL. Executar amostras de mídia em triplicado por LC-MS. Use “amostras de processo” no programa de quantificação junto com o método (*. mdb) e o arquivo de calibração (*. CDB). O método e a curva de calibração serão aplicados automaticamente às amostras de mídia bruta pelo aplicativo de quantificação depois que todas as injeções forem concluídas. Para exportar dados para análise em outro programa (como uma planilha), use o comando “Print” e crie um arquivo *. XPS ou *. pdf.