Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

1. Purification des anticorps REMARQUE : Le tampon d’équilibre pour l’anticorps interne est de 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. Le tampon d’élution utilisé est 0,1 M d’acide acétique. Les tampons et la résine (protéine A) dépendent de l’anticorps spécifique purifié. Le volume de la colonne est équivalent à la hauteur du lit de la résine. La quantité de phase mobile utilisée est déterminée en termes de volume de colonne. Initialisation du système de purification Ouvrez le logiciel attaché au système de purification. À l’aide d’instructions manuelles, équilibrez la colonne avec le tampon d’équilibre à un débit de 2 ml/min pendant 40 min. Arrêtez la course manuelle après l’équilibre. Dans le collecteur de fractions, placez 15 ml de tubes coniques pour recueillir les anticorps purifiés et les tubes coniques de 50 ml pour recueillir le flux pendant le lavage à haute teneur en sel. Assurez-vous que le collecteur de fractions est réinitialisé à la position de départ en ouvrant et en fermant le collecteur de fractions avant le début de la course. Le collecteur de fractions est maintenu à 7 oC.REMARQUE : Le collecteur de fractions peut être réinitialisé manuellement sous l’onglet Fraction Collector dans Paramètres,pour les tubes de 15 ml et 50 ml. Injection d’échantillonREMARQUE : Le fluide de culture cellulaire récolté utilisé dans les procédures suivantes a été obtenu à partir de cellules d’ovaire de hamster chinois cultivées dans des micro-bioréacteurs automatisés9. Ajouter le liquide de culture de cellules de récolte filtré de 0,22 m à une seringue vide de 12 ml dont l’extrémité de la buse est plafonnée. Tenir la seringue avec la buse vers le bas, insérer le piston de seringue jusqu’à ce qu’une petite partie du piston est po Pour vous assurer que le liquide ne fuit pas, tournez la seringue avec la buse vers le haut et retirez le bouchon. Toujours en tenant la seringue avec la buse vers le haut, poussez le cylindre pour dissiper tout air jusqu’à ce que le fluide de culture cellulaire est à la pointe de la buse. Insérez la buse de seringue dans le port d’injection manuelle sur le système de purification et tordez pour serrer. Poussez vers le bas sur le piston jusqu’à ce que tout l’échantillon soit injecté et soit visible dans la boucle d’échantillon de 10 ml de grand volume ci-jointe. Ouvrez le fichier de méthode enregistré. Enregistrez le fichier de résultat à l’emplacement requis et spécifiez le nom du fichier lorsqu’il est invité. Coup après que l’échantillon a été injecté dans la boucle d’échantillon de grand volume. Exécution de la méthode de purification Sélectionnez la méthode enregistrée et cliquez sur l’exécution lorsqu’il est invité par un logiciel d’instrument (étape 1.2.5).REMARQUE : Le système est mis en place pour exécuter les étapes suivantes. L’utilisateur n’a pas besoin de faire quoi que ce soit pendant que l’instrument est en cours d’exécution. Équilibrez la colonne avec trois volumes de colonne (CV) de tampon d’équilibre à un débit de 2 mL/min. Une fois que la colonne est liboudrée, le système, à l’aide de la boucle d’échantillon à grand volume, injectera l’échantillon sur la colonne à un débit de 1 ml/min. Une baisse du signal UV à 280 nm indique que l’échantillon est terminé de chargement. Laver la colonne avec un tampon d’équilibre à un débit de 2 ml/min jusqu’à ce que le signal UV tombe en dessous de 25 mAU. Utilisez quatre CV de 25 mM Tris avec 1 M NaCl au pH 7,5 pour effectuer un lavage secondaire à haute teneur en sel à un débit de 2 ml/min. Le collecteur de fractions du système recueillera toute protéine/ADN qui se détache de la colonne pendant le lavage au sel dans des tubes de 50 ml. Appliquer cinq CV de tampon d’élution à un débit de 1 mL/min pour élifier l’anticorps hors de la colonne. Recueillir l’éluate dans des tubes de 15 ml à base de signal UV; lorsque le signal UV 280 est supérieur à 35 mAU, la collecte commence; la collecte se termine lorsque le signal descend en dessous de 50 mAU; c’est ce qu’on appelle la coupe de pointe.REMARQUE : La coupe de pointe assure la normalisation des profils d’élution et évite les résidus de pointe d’élution qui peuvent contenir des agrégats protéiques24. Laver la colonne à l’aide de trois CV de tampon d’équilibre. La course se termine après l’étape de lavage. Après l’élution neutraliser immédiatement la protéine purifiée en utilisant 1 M Tris base à un pH de 5,5. Mesurer la concentration protéique à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume à 280 nm et 260 nm et stocker à 4 oC. Concentrez l’anticorps purifié à l’aide d’unités centrifuges (étape 2). Soumettez ensuite l’anticorps purifié à l’analyse de glycane à l’aide de LC-MS et après l’agrégation, analysez le profil à l’aide de SEC-MALS (étapes 3 et 4).REMARQUE : L’anticorps purifié ne doit pas être gelé sans autre échange de tampons, car de fréquents cycles de gel et de dégel peuvent causer l’agrégation et les précipitations. 2. Concentration d’anticorps purifiés REMARQUE : Le tampon Tris-acétate est neutralisé de 0,1 M d’acide acétique avec une base tris de 1 M à un pH de 5,5. Insérer des filtres 100 kDa dans des tubes de centrifugeuse. Laver les filtres avec 500 l’eau double distillée. Centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g à température ambiante (RT). Répétez cette étape deux fois. Jeter le filtrate. Transférer les filtres rincés dans des tubes de centrifugeuse frais et ajouter 500 ll d’échantillon à chaque filtre. Centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g. Inverser le filtre dans un tube de spin frais. Centrifugeuse pendant 2 min à 1 000 x g pour recueillir l’échantillon concentré. Déterminer les concentrations d’échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Videz le spectrophotomètre à l’aide d’une solution de tampon Tris-acétate. Utilisez un coefficient d’extinction des protéines de 1,37 mL(mg-cm)-1 à 280 nm pour une solution IgG de 1 % (% m/v). Utilisez l’échantillon concentré pour préparer une solution de travail de 2 mg/mL de 2 mg/mL pour l’analyse du glycane et de 30 oL de solution de travail de 3,5 mg/mL pour SEC-MALS.REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons doivent être réfrigérés à 4 oC. À une concentration de 2 mg/mL, ces échantillons devraient être stables pendant au moins trois mois à 4 oC, tandis que des concentrations plus élevées pourraient se précipiter. 3. Analyse des N-glycans à l’aide de la spectroscopie de masse Étiquetage n-glycan et isolement Commencez par des concentrations d’anticorps de 2 mg/mL dans un tampon approprié comme le phosphate de sodium neutre, le citrate ou le tampon HEPES. Préparer une norme de mAb intacte (comme le nIST mAb) à 2 mg/mL pour traiter à côté des échantillons expérimentaux pour servir de contrôle positif.REMARQUE : Les anticorps doivent être dans un tampon final ne contenant aucun SDS et moins de 0,1 mM de nucléophiles (tels que Tris, TNT, glycine ou histidine). Les SDD dans le tampon de l’échantillon doivent être supprimés. Si les nucléophiles sont dans le tampon, diluez-les vers le bas ou effectuez un échange de mémoire tampon puisqu’ils interfèrent avec le kit. Le protocole général est fourni avec le kit de glycan. Diluer 7,5 l des anticorps avec 15,3 l d’eau de qualité LC-MS dans des tubes de 1 ml fournis avec le kit, puis dénaturer à l’aide de 6 l de 5 % de solution d’un surfactant enzymatique et mS à 90 oC pendant 3 min. Refroidir les échantillons pendant 3 min à température ambiante (RT). Ensuite, ajouter 1,2 l de PNGase F et incuber pendant 5 min à 50 oC. Après avoir refroidi 3 min à RT, étiquetez les N-glycans clivés en ajoutant 12 l de réactif de marquage fluorescent dissous dans le diméthylformamide anhyus (DMF) et attendez 5 min. Diluer le mélange étiqueté N-glycan avec 358 l d’acétonitrile (ACN). Placez une plaque de chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC) dans un vide multiple avec des cales et un plateau de déchets. Utilisez une pipette multicanal pour un grand nombre d’échantillons. Conditionner les puits avec 200 l d’eau, où le vide est ajusté de sorte que le liquide prendra 15-30 s pour passer à travers la résine HILIC. Équilibrez-le avec 200 L de 85 % D’ACN avant de charger le mélange de glycane étiqueté acn dilué (400 l), en appliquant le vide après l’ajout de chaque nouveau liquide aux puits. Laver la résine avec 600 l de 1% d’acide formique (FA)/90% ACN deux fois. Remplacer le bac à déchets par des tubes de collecte de 600 l. Éluter les N-glycans étiquetés avec tampon d’élution SPE (3 élutions de 30 l chacun) dans les tubes de collecte. Diluer les élutions mises en commun avec 310 l de diluant d’échantillon DMF/ACN. Pipette les échantillons dans des flacons d’échantillonneur automatique pour être prêt pour l’analyse de fluorescence (FLR)-MS.REMARQUE : Ces échantillons sont stables lorsqu’ils sont entreposés à -80 oC pendant au moins 1 mois. Conservez la plaque HILIC dans son emballage d’origine, scotché fermé et à l’intérieur d’un dessiccateur pour une utilisation future. Analyse LC-MS des N-glycans étiquetés Analyser les échantillons d’élution N-glycan étiquetés sur un système de chromatographie liquide ultra-performance (UPLC) couplé à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse quadrupole (Q-ToF). Utilisez une colonne approuvée pour la séparation chromatographique des glycanes étiquetés et de la chaleur à 60 oC pendant les séparations.REMARQUE : La colonne doit être rincée avec 60 % d’acétonitrile et 40 % de H2O avant utilisation : 50 CV avant la première utilisation ou 20 CV si la colonne a déjà été utilisée. Utilisez 50 mM d’ammonium formate (AmF) (fabriqué avec du concentré de phase mobile) et 100% ACN de qualité LC-MS pour les phases mobiles. L’AmF est sensible aux changements de pH et est utilisable pendant 1 mois après le mélange. Définir le débit initial à 0,4 mL/min, le gradient LC fournissant une AmF croissante pendant la phase d’élution. Définir le détecteur FLR pour mesurer à EX 265/EM 425 nm avec un taux d’échantillonnage de 2 Hz. Définir le mode de sensibilité à l’ion positif Q-ToF à MS1, avec une plage de masse de 100-2 000 daltons (Da), un temps de balayage de 0,25 secondes et l’acquisition de données continuum. Utilisez la leucine enkephalin (2 ng/L dans 50% ACN/0.1% FA) pour la référence de masse interne, dans le mode “Ne PAS appliquer la correction”.REMARQUE : La correction interne de référence de masse sera appliquée plus tard pendant le traitement des données. Resuspendre l’échelle dextran séquentiellement en 22,5 l de H2O, 25 ‘L de DMF et 52,5 ‘L d’ACN. Préparer 10 aliquots ll pour le stockage à -80 oC, car l’échelle n’est pas stable pendant plus de 24 h à des températures plus élevées (température ambiante, 4 oC). L’échelle dextran se dégrade après plus d’un cycle de gel-dégel. Placer les échantillons dans l’échantillonneur automatique réglé à 10 oC. Chargez une fiole d’échelle dextran avec des échantillons, car les informations sur le temps de rétention de l’échelle seront utilisées pour les affectations tandis que les informations de masse utilisées pour valider les identifications. Utilisez 10 injections de L pour les échantillons et 7,5 injections de L pour l’échelle. Injecter des échantillons dans triplicate. Exécutez la méthode chargée. Identification N-Glycan pour les données LC-MS Effectuer le traitement des données avec un programme optimisé pour les données de spectrométrie de masse de fluorescence de la fluotométrie de la fluotométrie par interaction hydrophile (HILIC-FLR-MS). Appliquer des corrections de référence de masse internes dans le programme. Désigner les injections échelle dextran comme «standard» dans l’information de l’échantillon . Dans la méthode d’analyse, définir les temps de rétention des composés de séparation à ceux des composés de l’échelle qui ont été détectés au cours de la course. Pour vous assurer que le % de zone sera retourné pour les glycanes identifiés, modifiez la méthode d’analyse : Sous l’onglet Traitement, cliquez sur Paramètres de quantitation – Calibrer et définir le type « Courbe de calibration » pour « Réponse relative (%) ». 4. Analyse de l’agrégation d’anticorps à l’aide de SEC-MALS Préparation de l’échantillon Transférer la protéine diluée de 3,5 mg/mL (étape 2) dans un flacon avec un insert en verre de 150 l. Utilisez une pointe de chargement de gel à pipet dans la cloche inférieure de l’insert pour éviter l’introduction de bulles. Capuchon de la fiole avec un chapeau septa et d’analyser immédiatement. Conserver à 4 oC si vous analysez plus tard. Configuration et équilibre SEC-MALSREMARQUE : Analyser l’agrégation sur SEC-MALS configurée avec une chromatographie liquide ultra haute pression (UHPLC) avec un détecteur MALS et un détecteur d’indice réfractif contrôlé par le logiciel MALS. Configurer un fichier de méthode dans le logiciel UHPLC pour le contrôle du système UHPLC, en fixant le débit à 0,4 ml/min avec une phase mobile de 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) (dilué à partir de 10x), le volume d’injection à 5 oL, la température de la colonne à 25 oC , et le détecteur de diode Array (DAD) pour surveiller 280 nm. Définir la durée de l’exécution à 20 min. Équilibrez le système pendant au moins 4 h avant toute analyse d’échantillon. L’interface entre les détecteurs UHPLC et Multi Angle Light Scattering – Refractive Index (MALS-RI) nécessite l’utilisation de la sortie analogique sur le DAD. Régler l’atténuation DAD à 1.000 mAU dans le fichier de méthode DAD et au/UV réglage à 1 (instrument UV -gt;Channels ‘gt;Channel 1). Allumez la lampe DAD 30 min avant de commencer l’analyse et fixez la longueur d’onde à 280 nm. Dans le même temps, purger la cellule de référence de l’indice réfractif (IR) pendant 15 min ou jusqu’à ce que la ligne de base soit stable, puis fermer la cellule de référence. Configurer la séquence logicielle SEC-MALS, en réglant le temps de collecte à 12 min, le volume d’injection à 5 ll, le dn/dc à 0,185 mL/g, le coefficient d’extinction A280 s’il est précédemment déterminé expérimentalement ou à 1,37 mL (mg-cm)-1, et la concentration de la échantillon. Cliquez sur Exécuter et attendre que le dialogue « en attente d’injection » apparaisse à l’écran.REMARQUE : Le coefficient d’extinction de l’A280 est spécifique à la protéine d’intérêt et doit être déterminé expérimentalement. Configurer une liste d’échantillons dans le logiciel UHPLC dans le même ordre que dans le logiciel MALS-RI et soumettre.REMARQUE : Il est important d’exécuter un contrôle d’aptitude au système avant et après une course. L’albumine de sérum bovin est typiquement employée pour vérifier l’élargissement de pointe, un signe que la colonne de SEC peut avoir besoin de nettoyage ou de remplacement. La même injection standard BSA peut être utilisée pour spécifier l’alignement du signal, l’élargissement des pics et la normalisation des détecteurs. Analyse globale avec le logiciel MALS Cliquez sur l’onglet marqué Procédures. Spécifier le niveau minimum de despiking requis; aucun n’est généralement suffisant. Vérifier que les lignes de base ont été tracées correctement et ajuster si nécessaire, pour les canaux LS1, LS2, LS3, RI et UV. Définir la zone de pointe d’intérêt. Examinez la distribution de masse moléculaire pour confirmer que les pics appelés contiennent des particules de taille similaire. 5. Analyse de variante de charge Préparation et étiquetage de l’échantillon Commencez par 80 l d’une solution d’anticorps de 3,5 mg/mL. Desaler l’échantillon à l’aide d’une colonne de desalting de 0,5 ml (7 k MWCO). Préparer la colonne en claquant d’abord le bouchon inférieur, puis en desserrant le bouchon supérieur, et en la plaçant dans un tube micro centrifugeur de 1,7 mL. Centrifuger la colonne de dessalement pendant 1 min à 1 500 x g.REMARQUE : Marquez l’extérieur de la colonne avec un point afin qu’il puisse être placé dans l’orientation d’origine pour les prochaines étapes. Transférer la colonne dans un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter les 80 l de protéines diluées en haut de la colonne. Alignez la colonne à l’orientation d’origine. Centrifugeuse pendant 2 min à 1 500 x g. Retirer l’échantillon de la centrifugeuse, jeter la colonne de dessalement et bien mélanger l’échantillon.REMARQUE : Le dessalement n’est nécessaire que si la matrice de l’échantillon contient des amines primaires, des excipients qui perturberont l’électrophoresis de l’échantillon ou d’autres substances incompatibles. Diluer l’échantillon à une concentration finale de 2 mg/mL dans un volume de 25 l et ajouter 5 l de la mémoire tampon d’étiquetage (voir Tableau des matériaux : Kitde réactif variable de charge ) dans la plaque de 96 puits. Préparer le réactif d’étiquetage en diluant la quantité nécessaire de réactif d’étiquetage (voir Tableau des matériaux : Kitde réactif variable de charge ) 1:30 en diméthylformamide. Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante loin de la lumière.REMARQUE : Il est important de décongeler, puis d’utiliser immédiatement ce réactif et de l’utiliser dans les 10 minutes suivant le mélange avec dMF. Après l’incubation, ajouter 60 l d’eau de qualité réagent et bien mélanger par tuyauterie. Couvrir la plaque d’un joint de plaque et centrifuer la plaque à 1 000 x g pendant 1 min. Préparation de la puce variante de charge Préparer la puce Charge Variant en enlevant la solution de stockage et en lavant les puits 1, 3, 4, 7, 8 et 10 avec de l’eau. Remplacez ensuite l’eau par un tampon de fonctionnement pH 7.2 (voir Tableau des matériaux : Charger le kit de réactifvariable). Ajouter 750 ‘L de pH 7.2 tampon courant au tube tampon et placer le tube tampon à l’endroit indiqué sur le coin supérieur gauche du plateau de l’échantillon. Maintenant, retirez le joint de plaque de la plaque de 96 puits, appuyez sur Décharger la plaque sur l’interface utilisateur de l’instrument, et insérez la plaque dans le plateau d’échantillon GXII.REMARQUE : Des tampons pH 7.2 ont été utilisés pour cette analyse. pH 5.6-7.2 tampons peuvent être utilisés en fonction de la protéine pI. Lors de l’utilisation de tampons de pH plus bas, des temps d’exécution d’échantillons plus longs peuvent être nécessaires. Appuyez sur le bouton Décharger la puce sur l’interface utilisateur. Assurez-vous que les électrodes sont exemptes de toutes les particules, et si ce n’est pas, nettoyer avec un écouvillon sans pouf. Lors de l’insertion de la puce assurez-vous que la fenêtre au centre de la puce est exempte de particules ou de taches. Si nécessaire, nettoyer avec un chiffon souple sans peluches.REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des puces d’électrophoresis capillaires, retirez le tampon par aspiration sous vide, suivi de l’ajout immédiat de la solution suivante pour empêcher les puits de se dessécher. Pour minimiser l’introduction de bulles, pratiquez la technique de pipetage inversé. Lors de la manipulation de la puce, être conscient de la fragile capillaire s’étendant à partir du fond de la puce, en veillant à ce qu’il ne se dessèche pas et ne pas briser la manipulation rugueuse. Fermez le couvercle à la chambre à puce et sélectionnez l’assay HT Protein Charge Variant. Cliquez sur le bouton Exécuter. Suivez les invites pour sélectionner les puits de l’échantillon, le type de plaque, le temps d’assougat (68, 90 ou 100 s) et le nom du fichier. Cliquez sur Démarrer à la fin des invites. Le nettoyage des copeaux nécessite le lavage de chaque puits 2x avec de l’eau, suivie de l’ajout de tampon de stockage (voir Tableau des matériaux: Charger Variant Reagent Kit). Une fois dans le tampon de stockage, remplacez la puce dans l’instrument et, lorsqu’elle est invitée, sélectionnez l’assay HT Protein Charge. Sur l’écran principal, sélectionnez Wash sur l’interface utilisateur. Une fois terminée, retirer la puce, essuyer les électrodes avec de l’eau et un écouvillon sans conserve, et entreposer la puce à 4 oC. Analyse des variantes de charge Ouvrez le logiciel d’analyse des instruments. Importer la course en allant à File .’m.’import Data File… et en cliquant sur le fichier souhaité. Seul le nom sera reporté sur le logiciel, afin de renommer les puits est avantageux (Outils ‘gt; Sample Name Editor). Sélectionnez les fichiers à exporter en maintenant le décalage pendant la sélection des fichiers. Cliquer sur File -gt;Export… et sélectionnez la boîte Raw Data, puis la boîte format AIA. Ouvrez l’onglet Projets de navigation dans le logiciel d’analyse. Cliquez sur Database ‘gt;Import Data… et sélectionnez l’exporté. Fichiers CDF. Une fois importé, naviguez vers l’onglet Injections, sélectionnez les fichiers à analyser, cliquez à droite et accédez au processus… Dans la fenêtre qui apparaît, sélectionnez la case à cocher à côté du processus et sélectionnez la case radio « Utiliser la méthode de traitement spécifiée » et la méthode de traitement souhaitée à partir de la case déroulante. Dans la boîte déroulante immédiatement ci-dessous étiquetée “Comment:” sélectionnez Calibrate et Quantitate. Une fois traités, naviguez vers l’onglet Résultats et vérifiez l’intégration des chromatogrammes.REMARQUE : La méthode de traitement doit être vérifiée pour chaque méthode. Comme point de départ, les paramètres utilisés pour la méthode de traitement actuelle sont inclus dans le fichier supplémentaire.REMARQUE : L’exportation des données peut se faire sous la forme d’un rapport ou seule la quantification maximale peut être exportée. Ceux-ci peuvent être faits en même temps que le traitement ou à partir de la fenêtre de résultats. 6. Analyse des acides aminés Mise en place de la courbe standard pour la quantification absolue des acides aminés par LC-MS Préparer le mélange d’acide aminé étendu (EAA) en dissolvant 59,45 mg d’Asn, 59,00 mg d’Hyp, 65,77 mg de Gln, et 91,95 mg de Trp dans 25 ml de 0,1 N HCl. La concentration finale de chaque acide aminé dans le mélange EAA est de 18 nmol/L. Préparer la solution de stock standard interne (ISTD) en dissolvant 58,58 mg de Nva et 44,54 mg de Sar dans 50 ml de HCl. Préparer les normes complètes d’acides aminés en combinant la solution de stock d’acides aminés contenant Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val à 1 nmol/ L chacun avec le mélange EAA pour les concentrations finales d’acides aminés de 900 , 225, 90, 22,5 et 9 pmol/L. Ajouter le stock ISTD préparé aux normes d’acide aminé pour une concentration finale de 90 pmol/L ou 900 pmol/L pour créer des normes internes « faibles » et « élevées » à utiliser comme contrôles positifs pour la méthode. Placez les concentrations d’acides aminés dans des flacons d’échantillons dans l’autosampler de l’UPLC. Générer une courbe d’étalonnage (9 à 900 pmol/L) dans le logiciel d’instrument basé sur les concentrations standard d’acides aminés en utilisant les instructions suivantes. Utilisez le Q-ToF dans le mode de sensibilité positive à l’ionisation électrospray (ESI) couplé à un UPLC pour l’analyse intacte des acides aminés. Pour la séparation chromatographique, utilisez une colonne de phase normale faite pour les séparations d’acides aminés. Préparer les tampons suivants avec des réactifs de niveau de spectrométrie de masse : A -acétonitrile – 0,1 % d’acide formique et B à 100 mM de formatamium. Définir le débit de LC à 0,6 ml/min et la température de la colonne à 40 oC. Utilisez les conditions de gradient suivantes de 15 minutes pour les séparations d’acides aminés : 14 % B (0-3 min), 14-100 % B (3-10 min), 100 % B (10-13 min), 100-8 % B (13-14 min), 8 % B (14-15 min). Utilisez les listes de colonnes « Type d’échantillon » et « Conc A » dans le programme d’acquisition de SP afin de créer une courbe d’étalonnage pour l’analyse future des supports de bioréacteurs bruts dans le programme de quantitation. Pour que ces colonnes apparaissent dans le programme d’acquisition, utilisez l’affichage personnalisé… commandez lorsque vous cliquez à droite sur la barre de menu supérieure. Le type d’échantillon pour les normes d’acide aminé sera “Standard” tandis que les échantillons de médias seront “Analyte”. Remplissez la colonne « Conc A » avec les concentrations numériques des normes dans les unités requises (pmol/L). Exécuter les concentrations standard d’acides aminés préparés au moins deux fois. Validez que l’instrument UPLC et le spectromètre de masse fonctionnent correctement en vérifiant les pics ISTD. Utilisez l’option « Méthode d’édition » dans l’application de quantitation pour créer la méthode de quantitation (fichier .mdb). Définissez tous les acides aminés d’intérêt dans l’application de quantitation, tels que le nom composé, la valeur m/z et le temps de rétention prévu. Modifier les paramètres d’intégration de la méthode ici. Utilisez la méthode d’acide aminé créé sur les échantillons standard pour créer la courbe d’étalonnage. Cette courbe peut être exportée vers un fichier ‘.cdb’ pour une utilisation avec les échantillons de médias à l’aide de la commande Export.gt;Calibration… Dans l’application de quantitation, enregistrez la mise en page souhaitée dans un fichier ‘qlt’ à appliquer aux futurs jeux de données à l’aide de “Save Layout As…”. Nom (nom d’injection), Zone et Conc sont les colonnes de sortie les plus importantes. Analyse des acides aminés des médias de bioréacteurs bruts par LC-MS Le bioréacteur brut Centrifuge est de 1 962 x g pendant 5 minutes et passe à travers un filtre de 0,22 m. Suivi d’un nettoyage à l’acide perchlorique pour éliminer les protéines et les particules : mélangez le support bioréacteur filtré avec 0,4 N HClO4 à un ratio de 1:1 et centrifugeuse à 14 700 x g pendant 5 min à RT. Recueillir les médias clarifiés dans les flacons d’autosampler.REMARQUE : Ajuster le volume d’injection au besoin pour que les concentrations d’acides aminés se situent dans la plage d’étalonnage. Selon l’instrument, le volume d’injection peut être ajusté entre 0,1 et 10 L. Exécuter des échantillons multimédias en triplelicate par LC-MS. Utilisez des « échantillons de processus » dans le cadre du programme de quantitation ainsi que la méthode (.mdb) et le fichier d’étalonnage (.cdb). La méthode et la courbe d’étalonnage seront automatiquement appliquées aux échantillons de supports bruts par l’application de quantitation une fois toutes les injections terminées. Pour exporter des données pour analyse dans un autre programme (comme une feuille de calcul), utilisez la commande «Imprimer» et créer un fichier ‘.xps ou ‘.pdf’.