تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي
Summary
وقد وُصف بروتوكول مفصل لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة من سائل زراعة الخلايا المحصد (HCCF) من المفاعلات المجهرية الآلية وتحليلها لاحقاً. كما يتم عرض استخدام التحليلات لتحديد سمات الجودة الحرجة (CQAs) وتعظيم حجم العينة المحدود لاستخراج المعلومات الحيوية.
Abstract
الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هي واحدة من المنتجات البيولوجية الأكثر شعبية وتتميز بشكل جيد المصنعة اليوم. الأكثر شيوعا المنتجة باستخدام خلايا المبيض الهامستر الصينية (CHO) ، يجب تحسين الثقافة وظروف العملية لتحقيق أقصى قدر من titers الأجسام المضادة وتحقيق ملامح الجودة المستهدفة. عادة، يستخدم هذا التحسين المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية (15 مل) لفحص ظروف عملية متعددة بالتوازي. وتشمل معايير التحسين الأداء الثقافي وسمات الجودة الحرجة (CQAs) لمنتج الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb)، والتي قد تؤثر على فعاليته وسلامته. وتشمل مقاييس الأداء الثقافي نمو الخلايا واستهلاك المغذيات، في حين تشمل الـ CQAs ملامح N-glycosylation والتجميع الخاصة بـ mAb، ومتغيرات الشحن، والوزن الجزيئي. يصف هذا البروتوكول المفصل كيفية تنقية وتحليل عينات HCCF التي ينتجها نظام مفاعل ميكروبروبيو آلي للحصول على مقاييس ونواتج أداء قيّمة. أولا، بروتين آلي يتم استخدام طريقة بروتين سريع للكروماتوغرافيا السائلة (FPLC) لتنقية mAb من عينات زراعة الخلايا التي تم حصادها. وبمجرد تركيزها، يتم تحليل ملامح الغليكان عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام منصة محددة (راجع جدولالمواد). يتم تحديد الأوزان الجزيئية الأجسام المضادة وملامح التجميع باستخدام حجم استبعاد الكروماتوغرافيا متعددة زاوية تشتت الضوء (SEC-MALS)، في حين يتم تحليل المتغيرات تهمة باستخدام الكهروريس المنطقة الشعرية رقاقة (mCZE). بالإضافة إلى مقاييس الأداء الثقافي التي تم التقاطها أثناء عملية المفاعل الحيوي (أي قدرة الثقافة على البقاء، وحساب الخلايا، والأيض الشائع بما في ذلك الجلوتامين، والجلوكوز، واللاكتات، والأمونيا)، يتم تحليل الوسائط المستهلكة لتحديد المواد الغذائية المقيدة تحسين استراتيجيات التغذية وتصميم العملية الشاملة. ولذلك، يتم أيضا وصف بروتوكول مفصل للقياس الكمي المطلق للأحماض الأمينية عن طريق قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) من الوسائط المستهلكة. تستفيد الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول من الأنظمة الأساسية عالية الإنتاجية المتوافقة مع أعداد كبيرة من العينات ذات الحجم الصغير.
Introduction
يتم استخدام علاجات البروتين لعلاج مجموعة متنوعة متزايدة من الحالات الطبية بما في ذلك مضاعفات زراعة الأنسجة، واضطرابات المناعة الذاتية، والسرطانات1. منذ عام 2004، وثقت إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة (USFDA) نسبة متزايدة من طلبات الترخيص البيولوجي (BLAs) من جميع الموافقات التي ينظمها مركز تقييم الأدوية والبحوث (CDER)، مع BLAs تمثل أكثر من 25٪ في عامي 2014 و 20152.
وبالنظر إلى هذا السوق الآخذة في التوسع، تواجه الشركات المصنعة للمستحضرات الصيدلانية الحيوية تحديا مع تقديم المزيد من المنتجات بسرعة مع نوعية متسقة. وقد ركزت الجهود الرامية إلى زيادة إنتاج المنتجات على هندسة الخلايا CHO وفحص خط الإنتاج، على الرغم من أن أهم التحسينات تعزى إلى التقدم المحرز في تحسين استراتيجية وسائل الإعلام / تغذية والضوابط البيئية ثقافة الخلايا1، 3 , 4 , 5 خلال عملية التصنيع.
وبما أن الـ mAbs يتم إنتاجها في نظام بيولوجي، يمكن أن يكون هناك تباين البروتين المتأصل. يمكن تغيير تكوين الأجسام المضادة بعد الترجمة، مثل غليكوزيل أو تتأثر بالتدهور أو ردود الفعل الأنزيمية. هذه الاختلافات الهيكلية قد تثير ردود فعل مناعية خطيرة أو تغييرربط الأجسام المضادة، والتي بدورها يمكن أن تقلل أو القضاء على وظيفة العلاجية المقصود5 . وهكذا، يتم رصد ومراقبة سمات الجودة الحرجة (CQAs) من الأجسام المضادة أحادية النسيلة – الملف الشخصي N-غليكان، وتوزيع متغير المسؤول، والنسبة المئوية للجسم المضاد في شكل أحادي – بانتظام والسيطرة عليها كجزء من نهج الجودة حسب التصميم (QbD) خلال عمليات التصنيع1،6. في بيئة الإنتاج المنظمة، يجب أن تفي البروتينات العلاجية بمعايير القبول ليتم ترخيصها كمنتج دواء تجاري معتمد7. الطرق المعروضة هنا عادة ما تكون جزءا من عملية توصيف الجودة لجسم مضاد7،8، وسوف يكون أي عالم البروتين على دراية باستخدامها.
وفي العملالسابق 9، تم وصف تطبيق وتشغيل المفاعلات المجهرية لفحص الإنتاجية العالية لظروف زراعة الخلايا في المعالجة الأحيائية في المنبع. المنتج النقي الذي تم الحصول عليه من ظروف وسائل الإعلام المختلفة يخضع لتحليل N-glycan باستخدام LC-MS. يمكن الكشف عن أنماط Glycosylation من البروتينات العلاجية وتتميز باستخدام تقنيات LC-MS10،11،و وقد تم ربط وجود مختلف أنواع الجلايسان إلى المعلمات العملية الحيوية مثل استراتيجية تغذية، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة12. كما يتم تقييم تأثير ظروف الوسائط المختلفة على جودة المنتج، التي تشير إليها النسبة المئوية لـ IgG الناتجة في شكل أحادي، مع تحديد الحجم اللوني – تشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)13و14 , 15-يمثل ملف تعريف متغير الشحن عدداً من التعديلات16 التي يمكن أن تؤثر على وظيفة المنتج. الكهربائي للمنطقة المجهرية (mCZE) هو تقنية توفر وقت تحليل أسرع بكثير مقارنة بالتصوير اللوني التقليدي لتبادل الموجبة (CEX) وأساليب التركيز النظائري الشعرية (cIEF) المستخدمة في تحليل متغير الشحنة17 ،18. تم تحليل الوسائط مفاعل حيوي قضى لتتبع استهلاك الأحماض الأمينية أثناء إنتاج البروتين كما يتعلق بالتغيرات في سمات تحديد الأجسام المضادة19،20،21،22 , 23.
تسمح لنا تحليلات البروتين بتحديد معلمات العملية الحرجة (CPPs) استنادًا إلى العلاقات بين مدخلات العملية والتغيرات في الـ CQAs. وأثناء تطوير العمليات الأحيائية، فإن تحديد وقياس برامج الإنتاج الأنظف يبينان بشكل أساسي مراقبة العمليات ويضمنان عدم تغيير المنتج، وهو أمر أساسي في بيئات التصنيع التي تخضع لضوابط صارمة. في هذه الورقة، يتم عرض تقنيات تحليلية لقياس بعض الخصائص البيوكيميائية للبروتين الأكثر صلة بمنتجات CQAs (N-جليكان الشخصي، والمتغيرات المسؤولة، وتجانس الحجم).
Protocol
Representative Results
Discussion
يحتوي الصندوق على حطام وجسيمات كبيرة يمكن أن تسد وتدمر الأجهزة المكلفة، وبالتالي هناك حاجة إلى توضيح الثقافة قبل مزيد من المعالجة النهائية. الطرد المركزي هو عموما النهج الأول لفصل الخلايا وغيرها من الجسيمات غير القابلة للذوبان من البروتينات تليها الترشيح. ثم يخضع هذا HCCF المصفاة للبروتين السريع اللوني السائل (FPLC) لتنقية. تنقية HCCF من المفاعلات المجهرية الآلية للحصول على المنتج هو خطوة هامة في معالجة المصب. هنا، يتم استخدام نظام FPLC على سطح المقعد مع بروتين عمود A للحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة من HCCF. يمكن أن توفر تحليلات العمليات التمهيدية رؤية مفيدة لسلوك الخلايا وتوجه تصميم العمليات الحيوية، مما يساعد على الحصول على منتج جودة متسقة وموثوق بها. كما تسمح لنا Analytics بربط سمات الجودة الحرجة (CQAs) بالعمليات التمهيدية والنهائية. وترد هنا أربعة مقالات شائعة الاستخدام في توصيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وهذه التقنيات قوية وموثوق بها وقابلة للنشر بسهولة لتحليل العمليات والمنتجات من مجموعة متنوعة من مصادر المنبع التي لا تُطهى إلا جزئياً وقد لا تزال تحتوي على مستويات متبقية من الحمض النووي وHCP.
عند تنظيف العينات للتحليلات، يجب تحقيق توازن مهم بين إنشاء عينة نظيفة بما فيه الكفاية للتحليل مع الحفاظ على التباين الموجود في المفاعل الحيوي. والملوثات الأكثر شيوعاً التي تؤثر على المنتج هي الحمض النووي وHCP، والتي يمكن فحصها بقياس نسبة الامتصاص عند 260/280 نانومتر ومن خلال SDS-PAGE أو μCE-SDS. الاختبارات المعروضة هنا ليست حساسة لمستويات منخفضة من محتوى الحمض النووي. نقاء المنتج هو > 95٪ نقية، كما يحددها μCE-SDS.
تحليل متغير تهمة مع نظام الكهربائي microcapillary يوفر طريقة عالية الإنتاجية لتحديد المتغيرات تهمة، مع رقائق والكواشف التي هي سهلة نسبيا لتنفيذ. طبيعة هذه التقنية وكيمياء الكاشف وضع العلامات على حد سواء حساسة للسواغ وغيرها من الأمينات الأولية، وبالتالي تتطلب خطوة إزالة الأملاح لمعظم مصفوفات العينة. من الخبرة، وانخفاض مستويات الحمض النووي المشترك في الهجرة مع الصبغة الحرة من رد فعل وضع العلامات ولا تؤثر على نوعية النتائج. في حين أن تقلب القياس الكمي الأساسي والرئيسي والحمضي هو عادة <1%، فإن المستويات الأعلى من الحمض النووي والملوثات الأخرى يمكن أن تزيد من تقلب الفحص. من المهم للغاية أن تكون متسقة مع وضع العلامات البروتين وضمان الاستخدام الفوري لDMF بعد إزالة من الزجاجة ويجري مختلطة مع الصبغة. ينصح ليسين و / أو معايير الهيستيدين كضوابط وضع العلامات. مع مرور الوقت، واعتمادا على نوعية العينة، رقائق يمكن أن كريهة أو تفقد الطلاء على قنوات microfluidics، مما يؤدي إلى مزيد من الضوضاء، ووجود قمم شبح، والمزيد من عينة إلى عينة الاختلاف. ولتحديد هذا الحدوث، تم تحليل الفراغات ومعيار ملاءمة النظام (أي NISTmAb) في نفس الوقت مع العينات على فترات منتظمة. عندما تنشأ مشاكل رقاقة، يمكن غسلها رقائق مع حل التخزين أو استبدالها.
الأساليب المستخدمة لتحليل الجليكان من البروتينات السكرية العلاجية تنطوي في المقام الأول على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) و / أو قياس الطيف الكتلي (MS)، مع تحليل الكليكة الدقيقة تكتسب شعبية كخيار ثالث25. تستخدم الطريقة الموضحة في هذه الورقة كل من LC وMS، والتي لها فوائد وعيوب. الأساليب الطيفية الكتلية لها ميزة التحقق الشامل من الغليكانات التي تم تحليلها، وهو أمر غير ممكن باستخدام الأساليب المستندة إلى LC باستخدام إخراج الكشف الفلورسنت أو الكتين microarrays. يستخدم هذا الأسلوب LC والكشف عن الفلورة لتعيين هويات الغليكان باستخدام مقارنة وقت الاحتفاظ إلى معيار سلم dextran. ويتيح رصد الفلورة زيادة الحساسية والتحديد الكمي بسبب سهولة اكتشافه، حيث قد لا تتمكن التصلب المتعدد وحدها من تحديد كمية الأنواع ذات الوفرة المنخفضة بسبب ضعف كفاءة التأين في القلة. يتم استخدام المعلومات الجماعية من MS لتأكيد هويات الغليكان، ولكن برنامج المعالجة لا يستخدم المعلومات الجماعية كمعايير التعيين الأساسية. وبالتالي، دون الكروماتوغرافيا القابلة للاستنساخ والقمم القابلة للحل بسهولة، يمكن أن تعاني هذه الطريقة فيما يتعلق بمهام الغليكان. لحسن الحظ، يمكن أن تساعد المعلومات الجماعية في تخصيصات الغليكان حتى في الحالات التي يكون فيها التصوير اللوني دون المستوى، مثل التحولات في وقت الاحتفاظ التي تعوق تعيينات الغليكان القابلة للاستنساخ. إذا تم استخدام هذه الطريقة دون مرض التصلب العصبي المتعدد، يجب أن يكون اللوني على أعلى مستوى حيث لا يمكن استخدام المعلومات الجماعية لتصحيح الانجراف وقت الإقامة.
طريقة تحليل الأحماض الأمينية الموصوفة هنا يستخدم LC-MS لكمية سريعة من الأحماض الأمينية المنكفية في وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخام. تتطلب طرق تحليل الأحماض الأمينية البديلة عوامل اشتقاق الأحماض الأمينية لتمكين الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية26. طريقة LC-MS تقدم مزايا هامة على طريقة LC-UV: فهو يسمح لتحديد على أساس كل من وقت الاحتفاظ وكتلة أيون بدلا من طريقة LC-UV، والتي تقتصر على عدم وجود توصيف الكتلة. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة LC-MS توفر مزايا الوقت والتكرار، لأن طريقة LC-UV تتطلب تفاعل اشتقاق يستغرق وقتا طويلا، مما قد يضفي على عينة من التغير27. ومع ذلك، فإن حقن وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخام في طريقة LC-MS يمكن أن يسبب آثار ضارة على إشارة MS بسبب المقشدة أيون قاذورات. يتم حقن سلم المعايرة بشكل متكرر كفحص ملاءمة للنظام، ويتم عشوائية ترتيب العينة لمنع التحيز في البيانات.
وقد سبق وصف عملية زراعة الخلايا لإنتاج الأجسام المضادة باستخدام المفاعلات المجهرية9. في هذه الدراسة، يتم تعريف البروتوكولات التفصيلية لطرق توصيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تزيد من البيانات التي تم الحصول عليها من أحجام العينة المحدودة بشكل جيد. كميات محدودة من السائل زراعة الخلايا التي تم حصادها يمكن أن تقيد في بعض الأحيان معلومات المنتج المكتسبة واختيار الإجراءات التحليلية الصحيحة للحصول على بيانات جودة المنتج أمر ضروري. التحليلات مهمة لربط معلمات العملية التمهيدية مع التغيرات في جودة المنتج. هنا، يتم توفير مبدأ توجيهي للمستخدمين لتوصيف mAbs عند العمل مع المفاعلات الدقيقة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا سكوت لوت على الدعم التحليلي الذي قدمه. ويقدم برنامج المسار الحرج CDER (CA #1-13) التمويل والدعم الداخليين الجزئيين لهذا العمل. ويدعم هذا المشروع جزئيا تعيين في برنامج المشاركة في التدريب الداخلي / البحوث في مكتب منتجات التكنولوجيا الحيوية، وإدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة، التي يديرها معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم من خلال اتفاق بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأميركية وادارة الاغذية والعقاقير.
Materials
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
| Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
| µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
| 1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
| 1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
| 15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
| 150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
| 96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
| Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
| Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
| Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
| Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
| Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
| Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
| Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
| Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
| GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
| GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
| Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
| Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
| Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
| Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
| Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
| UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
| Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
| Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
| Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |
References
- . . Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
- New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015)
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
- Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
- . International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , (1999).
- Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
- Yang, J. -. M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
- Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
- Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
- Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
- Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
- Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
- Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
- Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
- Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
- Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
- Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O’Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
- Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
- Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
- Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).
