Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

1. antikor arıtma Not: in-House antikor için dengelemesinden tampon 25 mm Tris, 100 mm NaCl, pH 7,5. Kullanılan elüsyon tamponu 0,1 M asetik asittir. Tamponlar ve reçine (protein A) belirli antikor saflaştırılmış bağlıdır. Sütun hacmi reçine yatak yüksekliğine eşdeğerdir. Kullanılan mobil faz miktarı sütun hacmi açısından belirlenir. Arıtma sistemini başlatma Arıtma sistemine bağlı yazılımı açın. El ile talimatlar kullanarak, 40 dk için 2 ml/dak debisi ile dengelemesinden tampon sütun doğrultma. dengelemesinden sonra manuel çalışma durdurun. Fraksiyonal toplayıcı, yer 15 mL konik tüpler arındırılmış antikor atlatmak toplamak ve 50 mL konik tüpler akış-Through yüksek tuz yıkama sırasında toplamak için. Kesir toplayıcının başlangıç konumuna açmadan ve kesir toplayıcısını çalıştırmadan önce kapatılarak sıfırlandığından emin olun. Kesir toplayıcı 7 °C ‘ de korunur.Not: kesir toplayıcı el ile 15 mL ve 50 mL tüpler için Ayarlar, kesirli toplayıcı sekmesi altında sıfırlanabilir. Örnek enjeksiyonNot: aşağıdaki prosedürlerde kullanılan hasat hücre kültürü sıvısı, otomatik mikro-Bioreactors9’ da kültürleşmiş Çinli hamster yumurtalı hücrelerden elde edilmiştir. 0,22 μm süzülmüş hasat hücresi kültürü sıvısını, nozul ucu kaplı boş 12 mL şırıngaya ekleyin. Şırınga, nozul aşağı bakacak şekilde tutarak, dalgıç küçük bir kısmı gelene kadar şırınga pistonu takın. Sıvının sızdırmadığından emin olmak için, şırıngayı Meme yukarı bakacak şekilde çevirin ve kapağı çıkarın. Hala nozul yukarı bakacak şekilde şırınga tutarak, hücre kültürü sıvı meme ucunda olana kadar herhangi bir hava kaldırmak için silindir itin. Şırınga nozulu, arıtma sistemi üzerindeki manuel enjeksiyon bağlantı noktasına takın ve sıkın. Tüm numune enjekte edilinceye ve ekli 10 mL büyük hacim örnek döngüsünde görünür olana kadar piston üzerine itin. Kaydedilmiş Yöntem dosyasını açın. Sonuç dosyasını gerekli konuma kaydedin ve istendiğinde dosya adını belirtin. Örnek büyük hacimli örnek döngüye enjekte edildikten sonra Çalıştır tuşuna basın. Arıtma yöntemini çalıştırma Kaydedilmiş yöntemi seçin ve enstrüman yazılımı (adım 1.2.5) tarafından istendiğinde Çalıştır ‘ı tıklatın.Not: sistem aşağıdaki adımları çalıştırmak için ayarlanır. Cihaz çalışırken kullanıcının hiçbir şey yapması gerekmiyor. Sütunu, 2 ml/dak ‘lik bir akış hızında dengelemesinden buffer üç sütun hacmine (CVS) ile dengele. Sütun equilibrated sonra sistem, büyük hacimli örnek döngü kullanarak, 1 mL/dak akış hızında sütun üzerine örnek enjekte edecektir. 280 nm ‘de UV sinyalinde bir damla, numunenin yüklenmesini tamamlandığını gösterir. UV sinyali 25 mAU ‘nın altına düştüğünde, sütunu 2 mL/dak ‘Lik bir akış hızında Dengeleme tamponunu ile yıkayın. 2 mL/dak ‘Lik bir akış hızında ikincil yüksek tuz yıkama yapmak için pH 7,5 ‘de 1 M NaCl ile 25 mM Tris ‘in dört CVs ‘i kullanın. Sistem kesir toplayıcı 50 mL tüpler tuz yıkama sırasında sütundan gelen herhangi bir protein/DNA toplayacaktır. Sütun dışında antikor elute için 1 mL/dak akış hızında beş elüsyon buffer CVs uygulayın. UV sinyaline dayalı 15 ml borular içinde yıkantıdaki toplayın; UV 280 sinyali 35 mAU üzerinde olduğunda, koleksiyon başlar; 50 mAU altında sinyal düştüğünde koleksiyon biter; Bu en yüksek kesme denir.Not: pik kesme, elüsyon profillerinin normalleşmesini ve protein agregasyonu24’ ü içeren en yüksek üst kesmeyi önlemesini sağlar. Üç dengelemesinden buffer CVS kullanarak sütunu yıkayın. Çalışma, yıkama adımının ardından biter. Elüsyon hemen sonra 1 M Tris tabanı kullanarak arıtılmış proteini nötralize ~ 5,5 pH. 280 nm ve 260 Nm ‘de microvolume UV-Vis spektrofotometresini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve 4 °C ‘ de saklayın. Santrifüj üniteleri kullanarak arıtılmış antikor konsantre (adım 2). Sonra LC-MS kullanarak glikcan analizine arındırılmış antikor bağlı ve toplama profili SEC-, (adımlar 3 & 4) kullanarak analiz sonra.Not: temizleşmiş antikor daha fazla tampon değişimi olmadan dondurulmuş olmamalıdır sık donma-çözme döngüleri toplama ve yağış neden olabilir. 2. arıtılmış antikor konsantrasyonu Not: Tris-asetat tampon 0,1 M asetik asit ile nötralize 1 M Tris Base pH için ~ 5,5. 100 kDa filtreleri santrifüjlere yerleştirin. 500 μL çift damıtılmış su ile filtreleri yıkayın. Oda sıcaklığında (RT) 14.000 x g ‘de 10 dakika Santrifüjü. Bu adımı iki kez yineleyin. Filtrate atın. Durulama filtrelerini taze santrifüjlere aktarın ve her filtreye 500 μL örnek ekleyin. 14.000 x g’de 10 dakika Santrifüjü. Filtreyi yeni bir döndürme tüpüne çevirin. Konsantre numuneyi toplamak için 1.000 x g ‘de 2 dakika Santrifüjü. UV-Vis spektrofotometresini kullanarak örnek konsantrasyonları belirleyin. Spektrofotometreyi Tris-asetat tamponunun bir çözümünü kullanarak boş bırakın. 1,37 mL • (mg • cm)- 1% 1 (% m/v) IgG çözeltisi için 280 nm ‘de protein yok olma katsayısı kullanın. Glikol analizi için 2 mg/mL çalışma çözeltisi 12,5 μL ve SEC-LEI için 30 μL 3,5 mg/mL çalışma solüsyonu hazırlamak için konsantre numuneyi kullanın.Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Numuneler 4 °C ‘ de soğutulmuş olmalıdır. 2 mg/mL konsantrasyonda, bu numuneler 4 °C ‘ de en az üç ay boyunca stabil olmalıdır, ancak yüksek konsantrasyonlar çökebilir. 3. kütle spektroskopisi kullanılarak N-glycans Analizi N-glycan etiketleme ve yalıtım Nötr sodyum fosfat, sitrat veya HEPES tampon gibi uygun bir tampon içinde 2 mg/mL antikor konsantrasyonları ile başlayın. Pozitif bir kontrol olarak hizmet vermek için deneysel numunelerin yanında işlem yapmak için 2 mg/mL ‘de sağlam bir mAb standardı (NıST mAb gibi) hazırlayın.Not: antikorlar, SDS içermeyen son bir tamponda ve 0,1 mm ‘den daha az çekirdek (Tris, DTT, glisin veya histidin gibi) olmalıdır. Örnek arabelleğindeki SDS kaldırılmalıdır. Eğer nucleophiles tampon varsa, sonra onları seyreltmesi veya Kit ile müdahale çünkü bir tampon değişimi gerçekleştirin. Genel protokol glikan kiti ile sağlanır. 1 mL ‘Lik tüplerde 15,3 μL LC-MS-Grade su ile antikorların μL 7,5 ve daha sonra 3 dakika için 90 °C ‘ de 6 μL% 5 ‘ lik bir enzim-dostu ve MS-dostu yüzey çözeltisi kullanarak denilmesi. 3 dakika oda sıcaklığında (RT) için örnekleri serin. Ardından, 1,2 μL PNGase F ekleyin ve 50 °C ‘ de 5 dakika boyunca inküye yapın. Soğutma sonra 3 dk RT için, 12 μL floresan etiketleme reaktif susuz dimetilformamid (Dmf) içinde çözünür ekleyerek ve 5 dk için bekleyin, 358 μL Asetonitril (ACN) ile etiketli n-glikcan karışımı seyreltilir, parçalanabilen n-glycans etiket. Dolgu ve atık tepsisine sahip bir vakum manifoldunda hidrofilik etkileşim Kromatografi (HıNDıC) plakası yerleştirin. Çok sayıda numune için çok kanallı pipet kullanın. 200 μL su ile kuyular, vakum ayarlanır böylece sıvı 15-30 s HıDıC reçine üzerinden geçmek alacaktır. 200 μL ile equilibrate 85% ACN önce ACN-seyreltilmiş etiketli glikan karışımı (400 μL), her yeni sıvı kuyulara eklendikten sonra vakum uygulayarak. Reçineyi iki kez 600 μL% 1 formik asit (FA)/% 90 ACN ile yıkayın. Atık tepsisini 600 μL toplama tüpleri ile değiştirin. Etiketli N-glycans SPE elüsyon tampon ile (3 elutions 30 μL her) toplama tüpleri içine elute. 310 μL DMF/ACN numune seyreltici ile havuzlanmış elutions seyreltin. Floresans (FLR)-MS analizine hazır olmak için numuneleri otomatik örnekleme şişeleri içine pipet.Not: Bu örnekler en az 1 ay boyunca-80 °C ‘ de saklanırken kararlı durumdadır. HıCıC plakasını orijinal ambalajında saklayın, kapalı olarak bantlanmış ve gelecekteki kullanım için bir kurutucu içine atın. Etiketli N-glycans LC-MS Analizi Bir ultra performans sıvı kromatografi (UPLC) sisteminde etiketli N-glycan elüsyonu örneklerini bir floresan dedektörü ve dört ayaklı zaman-uçuş (Q-ToF) kütle spektrometresi ile eşleştirin. Ayrımlar sırasında etiketli glikan ve ısı 60 °c ‘ ye kromatografik ayırma için onaylanmış bir sütun kullanın.Not: sütun kullanmadan önce 60% Asetonitril ve 40% H2O ile temizlenmelidir: 50 ilk kullanımından önce CVS veya sütun daha önce kullanılırsa 20 CVS. 50 mM amonyum Format (AYF) (mobil faz konsantre ile yapılan) ve 100% LC-MS-Grade ACN mobil aşamaları için kullanın. AYF pH değişikliklerine duyarlıdır ve karıştırıldıktan sonra 1 ay boyunca kullanılabilir. Başlangıç debisi 0,4 mL/dak olarak ayarlayın, LC degradesi, elüsyon aşamasında artan AYF sağlar. 2 Hz örnekleme hızı ile EX 265/EM 425 nm cinsinden ölçmek için FLR dedektörü ayarlayın. 100-2000 Daltons (da), bir tarama süresi 0,25 saniye ve süreklilik veri alımı bir kütle aralığı ile bir s-ToF MS1 pozitif iyon hassasiyeti moduna ayarlayın. “Düzeltmeyi Uygula” modunda iç kütle referansı için lösin enkefalin (2 ng/μL, 50% ACN/0.1% FA) kullanın.Not: iç kütle başvuru düzeltmesi daha sonra veri işleme sırasında uygulanacaktır. Dekstran merdivenini sıralı olarak 22,5 μL H2O, 25 μL DMF ve 52,5 μL ACN ‘de yeniden askıya alın. Yüksek sıcaklıklarda 24 saat (Oda sıcaklığı, 4 °c) için merdiven kararlı olmadığı için-80 °c ‘ de depolama için 10 μL plakaya hazırlayın. Dekstran merdiven birden fazla donma-çözme döngüsü sonra düşer. Numuneleri Otomatik Örnekleyici olarak 10 °C ‘ ye yerleştirin. Numuneler ile birlikte dekstran merdiven bir şişe yük, merdiven bekletme süresi bilgileri atamaları için kullanılacak ise kitle bilgi kimliklerini doğrulamak için kullanılır. Merdiven için numune ve 7,5 μL enjeksiyonları için 10 μL enjeksiyonları kullanın. Örnekleri triplicate enjekte. Yüklenen yöntemi çalıştırın. LC-MS verisi için N-glycan tanımlaması Hidrofilik etkileşim Kromatografi floresan kütle spektrometresi (HıMıC-FLR-MS) verileri için optimize edilmiş bir program ile veri işleme gerçekleştirin. Program içinde dahili kütle başvuru düzeltmeleri uygulayın. Dekstran merdiven enjeksiyonları örnek bilgi”standart” olarak atayın. Çözümleme yöntemi’Nde, ayırma bileşik bekletme sürelerini, çalışma sırasında algılanan merdiven bileşiklere ayarlayın. % Alan ‘ın tanımlanan Glikanlar için döndürüleceğini sağlamak için analiz yöntemini değiştirin: işleme sekmesinin altında, quantitation ayarları -kalibre et ‘ı tıklayın ve “kalibrasyon eğrisi Sığdır türü” yı “bağıl yanıt (%)” olarak ayarlayın. 4. sn-EMILER kullanarak antikor toplama Analizi Numune hazırlama 3,5 mg/mL (adım 2) seyreltilmiş proteini 150 μL cam kesici uç ile bir şişeye aktarın. Kabarcıkların giriş önlemek için kesici uç alt çan içine pipet için bir jel yükleme ucu kullanın. Bir septa kap ile şişe kap ve hemen analiz. Daha sonra analiz ederseniz 4 °C ‘ de saklayın. SEC-bir yapılandırma ve dengelemesindenNot: bir ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografi (UHPLC) ile yapılandırılan SEC-,,,,,,, bir,,,,,,,,,,,,,,,,,, bir,, UHPLC sisteminin kontrolü için UHPLC yazılımındaki bir yöntem dosyasını yapılandırın, akış hızını 0,4 mL/dak ‘ye ayarlayarak 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) (10X ‘dan seyreltilmiş), enjeksiyon hacmi 5 μL, sütun sıcaklığı 25 °C ‘ ye kadar ve 280 nm izlemek için diyot dizi dedektörü (DAD). Çalışma süresini 20 dakika olarak ayarlayın. herhangi bir numune analizinden önce sistemi en az 4 saat Dengelentir. UHPLC ve Multi Angle ışık saçılma-refraktif Endeks (Iler-RI) dedektörleri arasındaki arayüz, baba üzerindeki analog çıktının kullanılmasını gerektirir. Dad Yöntem dosyası ve AU/UV ayarı 1 (UV enstrüman ≫ Channels ≫ Channel 1) 1.000 Mau için baba zayıflatma ayarlayın. Başlangıç analizi için 30 dk önce DAD lambası açın ve 280 nm dalga boyu ayarlayın. Aynı zamanda, refraktif Endeks (RI) referans hücresini 15 dakika veya taban çizgisi kararlı olana kadar temizleyin ve ardından başvuru hücresini kapatın. SEC-, 12 dakika, enjeksiyon hacmi 5 μL, DN/DC 0,185 mL/g, A280 tükenme katsayısı daha önce deneysel olarak belirlenen veya 1,37 mL * (mg * cm)-1, ve konsantrasyonu Örnek. Çalıştır ‘ ı tıklatın ve ekranda görünmesi için “ekleme bekleniyor” iletişim kutusunu bekleyin.Not: A280 yok olma katsayısı, ilgi proteinine özeldir ve deneysel olarak belirlenmelidir. UHPLC yazılımında, bir örnek listesini,, ya da aynı sırada bir şekilde yapılandırarakNot: bir sistem uygunluğu denetimi önce ve sonra bir çalıştırma çalıştırmak önemlidir. Sığır serum albümin genellikle en yüksek genişlemeyi kontrol etmek için kullanılır, SEC sütununun temizlenmesi veya değiştirilmesi gerekebilir bir işaret. Aynı BSA standart enjeksiyon sinyal hizalama, tepe genişleştirme ve dedektör normalleştirme belirtmek için kullanılabilir. Agrega yazılımı ile toplu analiz Sekme işaretlenmiş yordamlarıtıklatın. Gerekli despiking minimum düzeyini belirtin; hiçbiri genellikle yeterlidir. Temel çizgilerinin doğru çizilmiş ve gerekirse, LS1, LS2, LS3, RI ve UV kanalları için ayarlamak doğrulayın. İlgi tepe alanını ayarlayın. Adlandırılan doruklarına benzer boyutta parçacıklar içerdiğini onaylamak için moleküler kitle dağılımını gözden geçirin. 5. şarj varyantı Analizi Numune hazırlama ve etiketleme 3,5 mg/mL antikor çözeltisi 80 μL ile başlayın. 0,5 mL desalting sütun (7k MWCO) kullanarak örnek Desalt. İlk alt stoper kapalı yakalama, sonra üst stoper gevşeterek ve bir 1,7 mL mikro-Santrifüjü tüp yerleştirerek sütun hazırlayın. 1.500 x g’de 1 dakika boyunca tuz çözme sütununu santrifüjün.Not: bir nokta ile sütunun dış Işaretle, böylece sonraki adımlar için özgün oryantasyona yerleştirilebilir. Sütunu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. 80 μL seyreltilmiş proteinin sütunun üstüne ekleyin. Sütunu orijinal oryantasyona hizalayın. 1.500 x g’de 2 dakika Santrifüjü. Santrifüjden örnek çıkarın, Petrolün tuzsuzlaşması sütunu atmak ve örnek iyi karıştırın.Not: desalting sadece örnek matrisin primer aminler içeriyorsa, örnek Elektroforez veya diğer uyumsuz maddeleri Perturb edecek uyarılıklar gereklidir. Numuneyi 25 μL ‘lık bir hacimde 2 mg/mL ‘Lik son konsantrasyona seyreltin ve 96-kuyu plakasında 5 μL etiketleme tamponu (bkz. malzeme tablosu: şarj varyantı reaktif kiti) ekleyin. Etiketleme reakajını gerekli miktarda etiketleme reakajının seyreltilmesiyle hazırlayın (bkz. malzeme tablosu: şarj varyant reaktif kiti) 1:30 dimethylformamid içinde. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıktan uzağa inkulat.Not: çözme ve sonra hemen bu reaktif kullanın ve DMF ile karıştırma 10 dakika içinde kullanmak önemlidir. İnküreme işleminden sonra, 60 μL reaktif sınıfı su ekleyin ve pipetleme ile iyi karıştırın. Plakayı bir plaka mührü ile Kapla ve plakası 1.000 x g ‘de 1 dakika santrifüjle. Şarj varyantı çipini hazırlama Depolama çözeltisi ve yıkama kuyuları 1, 3, 4, 7, 8 ve 10 su ile kaldırarak şarj varyantı çipini hazırlayın. Daha sonra pH 7,2 çalışan tampon ile suyu değiştirin (bkz. malzeme tablosu: şarj varyantı reaktif kiti). 750 μL pH 7,2 tampon tüpüne tampon çalışan ekleyin ve arabellek tüpünü örnek tepsinin sol üst köşesindeki belirtilen noktaya yerleştirin. Şimdi 96-Well plakasının plaka mührü çıkarın, enstrüman Kullanıcı arayüzünde boşaltma plakası tuşuna basın ve plakayı gxıı örnek tepsisine takın.Not: Bu analiz için pH 7,2 tamponlar kullanıldı. pH 5.6-7.2 tampon protein pI ‘ye bağlı olarak kullanılabilir. Düşük pH arabellekleri kullanırken, daha uzun örnek çalışma süreleri gerekebilir. Kullanıcı arabiriminde Chip kaldırma düğmesine basın. Elektrotların herhangi bir parçacıklardan serbest olduğundan emin olun ve değilse, bir tüy bırakmayan ücretsiz Swab ile temizleyin. Yongası takarken, çipin merkezindeki pencerenin parçacık veya leke olmadığından emin olun. Gerekirse, tüy bırakmayan yumuşak bir bezle temizleyin.Not: kapiller Elektroforez yongaları ile çalışırken, vakum aspirasyonu ile tampon kaldırmak, kuyuları kurutmak önlemek için bir sonraki çözümün hemen eklenmesi takip. Baloncuklar giriş en aza indirmek için, pratik ters pipetleme tekniği. Yongası işlerken, çipin alt kısmından uzanan kırılgan kapiller dikkatli olun, Kuru değil ve kaba elleçleme yoluyla kırmaz emin hale. Çip odasına kapağı kapatın ve HT protein şarj varyant assay seçin. Çalıştır düğmesini tıklatın. Örnek kuyuları, plaka türünü, tahlil süresini (68, 90 veya 100 s) ve dosya adını seçmek için yönergeleri izleyin. İstemler sonunda Başlat ‘ı tıklatın. Çip temizleme her iyi 2x su ile yıkama gerektirir, depolama tampon eklenmesi takip ( malzeme tablosu: şarj varyant reaktif kiti). Bir kez depolama tampon, enstrüman içinde çip değiştirin ve istendiğinde, HT protein şarj tahlil seçin. Ana ekranda Kullanıcı arayüzünde yıkama ‘yı seçin. Tamamlandıktan sonra, yongası çıkarın, elektrotları su ve tüy bırakmayan bir çubukla silin ve yongası 4 °C ‘ de saklayın. Şarj varyantı Analizi Enstrüman analiz yazılımını açın. Dosya ≫ Import veri dosyası’na giderek Çalıştır alma… ve istenen *. GXD dosyasına tıklayarak. Sadece isim yazılım üzerinde, bu yüzden kuyular yeniden adlandırılması avantajlıdır (araçlar ≫ örnek adı düzenleyici) taşınır. Dosyaları seçerken Shift tuşunu basılı tutarak dışa aktarılacak dosyaları seçin. Dosya ≫ dışa aktar ‘ı tıklatın … ve ham veri kutusunu ve ardından AIA biçimi kutusunu seçin. Analiz yazılımı içindeki projeleri Gözat sekmesine açın. Veritabanı ≫ Ithalat veri… tıklayın ve dışa * seçin. CDF dosyaları. Bir kez ithal, enjeksiyon sekmesine gidin, analiz edilecek dosyaları seçin, sağ tıklayın ve işlem gidin. .. Açılan pencerede, işlem ‘in yanındaki onay kutusunu seçin ve açılır kutusundan “belirtilen Işleme yöntemini kullan” radyo kutusunu ve istenen işleme yöntemini seçin. “Nasıl:” etiketli hemen aşağıda açılan kutuda kalibre et ve Quantitate ‘i seçin. İşlendikten sonra sonuçlar sekmesine gidin ve kromatogramları tümleştirmesini kontrol edin.Not: işleme yöntemi her yöntem için doğrulanması gerekir. Başlangıç noktası olarak, geçerli işleme yöntemi için kullanılan parametreler ek dosyasına eklenir.Not: veri verme işlemi bir rapor şeklinde yapılabilir veya yalnızca en yüksek ölçüte verilebilir. Bunlar işlem veya sonuçlar penceresinden aynı zamanda yapılabilir. 6. amino asit Analizi LC-MS tarafından mutlak amino asit ölçümü için standart eğrisi ayarlama Genişletilmiş amino asit hazırlamak (EAA) karışımı tarafından çözünerek 59,45 mg ASN, 59,00 mg HYP, 65,77 mg gln, ve 91,95 mg TRP içinde 25 mL içinde 0,1 N HCl. EAA karışımı her amino asit son konsantrasyon 18 nmol/μL. Dahili standart (ıSTD) stok çözeltisi 58,58 mg NVA ve 44,54 mg SAR olarak 50 mL HCl ‘de çözünerek hazırlayın. Al, ASP, arg, CYS, Glu, GLY, onun, Ile, Leu, met, Phe, Pro, ser, THR, TRP, Tyr, Val 1 nmol/μL, 900 son amino asit konsantrasyonları için EAA karışımı ile içeren amino asit stok çözüm birleştirerek tam amino asit standartlarını hazırlayın , 225, 90, 22,5 ve 9 pmol/μL. Yöntem için pozitif kontroller olarak kullanılmak üzere “düşük” ve “yüksek” dahili standartlar oluşturmak için, 90 pmol/μL veya 900 pmol/μL ‘nin son konsantrasyonu için hazırlanan ıSTD stokları amino asit standartlarına ekleyin. Numune şişeleri amino asit konsantrasyonları UPLC Otomatik Örnekleyici yerleştirin. Aşağıdaki talimatları uygulayarak amino asit standart konsantrasyonlarına dayalı olarak enstrüman yazılımında bir kalibrasyon eğrisi (9-900 pmol/μL) oluşturun. Sağlam amino asit analizi için bir UPLC ‘ye bağlanmış elektrosprey iyonizasyon (ESı) pozitif duyarlılık modunda Q-ToF kullanın. Kromatografi ayrımı için, amino asit ayrımı için yapılan normal faz sütununu kullanın. Aşağıdaki tamponları Kütle Spektrometrisi dereceli reaktifler ile hazırlayın: A = Asetonitril + 0,1% formik asit ve B = 100 mM amonyum Format. LC akış hızını 0,6 mL/dak ve sütun sıcaklığına 40 °C ‘ ye ayarlayın. Amino asit ayrımları için aşağıdaki 15 dakikalık gradyan koşullarını kullanın: 14% B (0-3 dak), 14-100% B (3-10 dk), 100% B (10-13 dk), 100-8% B (13-14 dk),% 8 B (14-15 dk). MS edinme programında “numune türü” ve “CONC A” sütun listelerini kullanarak kantitasyon programında ham biyoreaktör medyanın gelecekteki analizi için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bu sütunların edinme programında görünmesini sağlamak için, üst menü çubuğuna sağ tıkladığınızda Display… Özelleştir komutunu kullanın. Amino asit standartları için örnek tip “standart” olacak ise medya örnekleri “analit” olacaktır. “CONC A” sütununu gerekli ünitelerin sayısal konsantrasyonlarıyla doldurun (örn: pmol/μL). Hazırlanmış amino asit standart konsantrasyonlarını en az iki kez çalıştırın. ISTD zirveleri kontrol ederek UPLC enstrüman ve kütle spektrometresi düzgün çalıştığını doğrulayın. Kantitasyon yöntemi (*. mdb dosyası) oluşturmak için kantitasyon uygulamasında “yöntemi Düzenle” seçeneğini kullanın. Bileşik adı, m/z değeri ve beklenen bekletme süresi gibi kantitasyon uygulamasında ilgi tüm amino asitler tanımlayın. Burada yöntemin tümleştirme parametrelerini değiştirin. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için standart örneklerde oluşturulan amino asit yöntemini kullanın. Bu eğri, dışa aktar ≫ Calibration… komutunu kullanarak medya örnekleriyle kullanılmak üzere bir *. cdb dosyasına verilebilir. Kantitasyon uygulamasında, “düzeni farklı kaydet…” kullanarak gelecekteki veri kümelerini uygulamak için istediğiniz düzeni bir *. qLt dosyasına kaydedin. Adı (enjeksiyon adı), alan ve CONC en önemli çıktı sütunlardır. LC-MS tarafından ham biyoreaktör medyanın amino asit Analizi 5 dakika boyunca 1.962 x g ‘de Santrifüjsüz ham biyoreaktör medya ve 0,22 μm filtreden geçer. Protein ve partikül madde kaldırmak için bir perklorik asit Temizleme ile takip: 0,4 N HClO4 ile filtrelenmiş biyoreaktör medya 1:1 oranında karıştırın ve 5 dk RT için 14.700 x g Santrifüjü. Otomatik Örnekleyici şişeleri içinde açıklığa kavuşturuldu medya toplayın.Not: amino asit konsantrasyonları kalibrasyon aralığı içinde düşmek yapmak için gerektiği gibi enjeksiyon hacmi ayarlayın. Cihaza bağlı olarak, enjeksiyon hacmi 0,1 μL ile 10 μL arasında ayarlanabilir. Medya örneklerini LC-MS tarafından triplicate olarak çalıştırın. Yöntem (*. mdb) ve kalibrasyon dosyası (*. cdb) ile birlikte kantitasyon programı altında “proses örnekleri” kullanın. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra yöntem ve kalibrasyon eğrisi otomatik olarak nicesi uygulaması tarafından ham medya örneklerine uygulanır. Başka bir programda (örneğin, elektronik tablo gibi) analiz için veri vermek üzere “Yazdır” komutunu kullanın ve bir *. XPS veya *. PDF dosyası oluşturun.