טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

1. טיהור נוגדנים הערה: מאגר השפה של הנוגדן בבית הוא 25 מ”מ Tris, 100 מ”מ הנאל, pH 7.5. המאגר המשמש לשימוש הוא חומצה אצטית 0.1 M. המאגרים והשרף (חלבון A) תלויים בנוגדן המסוים שטוהר. נפח העמודה שווה ערך לגובה המיטה של השרף. כמות השלב הנייד שבשימוש נקבעת במונחים של נפח עמודה. מאתחל את מערכת הטיהור פתח את התוכנה המצורפת למערכת הטיהור. באמצעות הוראות ידניות, השווה את העמודה עם מאגר השפה בקצב זרימה של 2 מ”ל/min עבור 40 דקות. עצור את ההפעלה הידנית לאחר שיעור. באספן שבר, מקום 15 מ”ל שפופרות חרוט לאסוף נוגדנים מטוהרים משחרל ו 50 mL שפופרות חרוט לאסוף זרימה-דרך במהלך שטיפת מלח גבוה. ודא שאספן השברים מאופס למיקום ההתחלה על-ידי פתיחה וסגירה של מלקט השבר לפני תחילת ההפעלה. אספן השברים נשמר ב -7 ° c.הערה: ניתן לאפס את מלקט השבר באופן ידני תחת הכרטיסיה ‘ אספן שבר ‘ בהגדרות, עבור שני מנורות mL ו-50 ml. הזרקת דגימההערה: נוזל התרבות תאים שנקטפו בשימוש בהליכים הבאים התקבל מן הסינית תאים שחלות אוגר תרבותי במיקרו-bioreactors חקנים אוטומטיים9. הוסף את נוזל הקציר מסוננים 0.22 יקרומטר של הגידול למזרק ריק משנת 12 mL שקצה הזרבובית שלו מוככה. הכניסו את המזרק עם הזרבובית הפונה כלפי מטה, הכנס את המזרק עד שחלק קטן מהבוכנה בפנים. וודא כי הנוזל אינו דולף, לסובב את המזרק עם הזרבובית פונה כלפי מעלה ולהסיר את הכובע. עדיין מחזיק את המזרק עם הזרבובית הפונה כלפי מעלה, לדחוף את הצילינדר כדי לפזר את כל האוויר עד שהנוזל של תרבות התא הוא בקצה הזרבובית. הכנס את זרבובית המזרק לתוך יציאת ההזרקה הידנית במערכת הטיהור ופיתול כדי להדק. לחץ על הבוכנה עד שכל המדגם מוזרק והוא גלוי בלולאה המצורפת של 10 מ”ל לדוגמה בנפח גדול. פתח את קובץ השיטה שנשמר. שמור את קובץ התוצאות במיקום הדרוש וציין את שם הקובץ כשתתבקש. הכה לרוץ לאחר המדגם הוזרק לתוך לולאה גדולה לדוגמה נפח. הפעלת שיטת הטיהור בחר את השיטה השמורה ולחץ על הפעל כאשר תתבקש על-ידי תוכנת מכשיר (step 1.2.5).הערה: המערכת מוגדרת להפעיל את השלבים הבאים. המשתמש אינו צריך לעשות דבר כאשר המכשיר פועל. השפה הכוללת שלושה אמצעי אחסון של עמודות (קורות חיים) של מאגר משקל בקצב זרימה של 2 mL/min. לאחר שהעמודה מעורפלת, המערכת, המשתמשת בלולאה הגדולה לדוגמה, תזריק את המדגם אל העמודה בקצב הזרימה של 1 mL/min. ירידה באות UV ב 280 ננומטר מציין כי המדגם הוא סיים טעינה. שטוף את הטור בעזרת מאגר השפה בקצב זרימה של 2 מ”ל/min עד שהאות UV יורד מתחת ל -25 מאו. השתמש ארבע קורות חיים של מיני טריס 25 מ”מ עם 1 M הנאל ב-pH 7.5 לבצע שטיפת מלח גבוהה משנית בקצב הזרימה של 2 מ”ל/min. אספן שבר מערכת תאסוף כל חלבון/דנ א שיורד העמודה במהלך שטיפת מלח בצינורות 50 mL. החלת חמש קורות חיים של מאגר הימנעות בקצב זרימה של 1 mL/min כדי להוריד את הנוגדן מהעמודה. לאסוף את להתחמק 15 צינורות mL מבוסס על אות UV; כאשר האות UV 280 מעל 35 מאו, אוסף מתחיל; האוסף מסתיים כאשר האות יורד מתחת 50 מאו; זה נקרא שיא החיתוך.הערה: חיתוך השיא מבטיח נורמליזציה של פרופילי משחררות וכלה להימנע ממעקב אחר שיא שעשוי להכיל אגרגטים חלבונים24. שטוף את הטור באמצעות שלוש קורות חיים של מאגר שיווציה. הריצה נגמרת לאחר. שלב השטיפה לאחר הימנעות מיד לנטרל את חלבון מטוהרים באמצעות 1 בסיס טריס M ל-pH של ~ 5.5. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות מיקרוvolume UV-Vis ספקטרוסקופיה ב 280 nm ו 260 nm ולאחסן ב 4 ° c. רכז את הנוגדן הטהור באמצעות יחידות צנטריפוגלי (שלב 2). לאחר מכן הנושא את הנוגדן מטוהרים כדי גליקן ניתוח באמצעות LC-MS ואחרי פרופיל הצבירה לנתח באמצעות SEC-דוליטל (שלבים 3 & 4).הערה: הנוגדן הטהור לא צריך להיות קפוא ללא החלפת מאגר נוספת כמו תכופים הקפאת ההפשרה מחזורים יכול לגרום צבירה ומשקעים. 2. ריכוז של נוגדנים מטוהרים הערה: החוצץ טריס-אצטט הוא 0.1 M חומצה אצטית מנוטרל עם 1 בסיס טריס M ל-pH של ~ 5.5. הכנס 100 מסנני kDa לצינורות צנטריפוגה. לשטוף את המסננים עם 500 μL של מים כפולים מזוקקים. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר (RT). חזור על שלב זה פעמיים. מחק filtrate. העבר את מסנני שוטפים לצינורות צנטריפוגה טריים ולהוסיף 500 μL של דגימה לכל מסנן. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 14,000 x g. הפוך את המסנן לשפופרת ספין חדשה. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g כדי לאסוף את המדגם מרוכז. לקבוע את ריכוזי לדוגמה באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis. לסרק את הספקטרוסקופיה באמצעות פתרון של מאגר אצטט-Tris. השתמש מקדם השמדת חלבון של 1.37 mL • (mg • ס מ) -1 ב 280 nm עבור 1% (% m/v) פתרון igg. השתמש במדגם מרוכז כדי להכין 12.5 μL של 2 mg/mL עובד פתרון לניתוח גליקן ו 30 μL של 3.5 mg/mL פתרון העבודה עבור SEC-דוליטל.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הדוגמאות אמורות להיות מקורר ב -4 ° c. בריכוז 2 מ”ג/mL, דוגמאות אלה אמורות להיות יציבות למשך שלושה חודשים לפחות ב -4 ° c בעוד שריכוזים גבוהים יותר עלולים לזרז. 3. אנליזה של N-גליקנים באמצעות ספקטרוסקופיית מסה התוויות והבידוד של N-גליקן התחל עם ריכוזי נוגדנים של 2 מ”ג/mL במאגר המתאים כגון נתרן פוספט ניטרלי, ציטראט או מאגר HEPES. הכן תקן mAb שלם (כגון רופא ממ) ב 2 מ”ג/mL כדי לעבד לצד דגימות ניסיוני לשמש שליטה חיובית.הערה: על הנוגדנים להיות במאגר הסופי המכיל לא SDS ופחות מ-0.1 מ”מ נוקלאופילים (כגון טריס, DTT, גליצין או histidine). יש להסיר SDS במאגר המדגם. אם נוקלאופילים נמצאים במאגר, לאחר מכן לדלל אותם או לבצע חילופי מאגר מאז הם יפריעו הערכה. הפרוטוקול הכללי מסופק עם ערכת גליקן. לדלל 7.5 μL של נוגדנים עם 15.3 μL של מים LC-MS-כיתה 1 בצינורות mL שסופקו עם הערכה ולאחר מכן באמצעות שימוש 6 μL של 5% הפתרון של האנזים ידידותי וטרשת נפוצה MS-ידידותית ב 90 ° c עבור 3 דקות. לצנן את הדגימות עבור 3 דקות לטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, הוסף 1.2 μL של PNGase F ו-דגירה עבור 5 דקות ב 50 ° c. לאחר הקירור 3 דקות כדי RT, התווית את N-גליקנים ביקקים על ידי הוספת 12 μL של תיוג פלורסנט מומס התפרקה באמצעות הידרומטר diמתילאומיד (DMF) ולחכות 5 דקות. לדלל את התערובת N-גליקן עם 358 μL של acetonitrile (ACN). מניחים כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופיפילית (HILIC) צלחת ביריעה ואקום עם שימים ומגש פסולת. השתמש בפיפטה רב-ערוצית עבור מספר רב של דגימות. מצב בארות עם 200 μL של מים, איפה הוואקום מותאם כך הנוזל ייקח 15-30 s לעבור דרך שרף HILIC. משקל עם 200 μL של 85% ACN לפני טעינת התערובת התווית ACN-מדולל מתויג (400 μL), החלת ואקום לאחר כל נוזל חדש מתווסף הבארות. לשטוף את שרף עם 600 μl של 1% החומצה פורמית (פא)/90% acn פעמיים. החלף את מגש הפסולת בעזרת צינורות אוסף של 600 μL. אליוט מתויג N-גליפחיות עם מאגר משחררן של SPE (3 שעות של 30 μL כל אחד) לתוך צינורות האוסף. לדלל את המאגר עם 310 μL של DMF/ACN לדוגמה מדלל. פיפטה את הדגימות לתוך בדיקות הסמפלר אוטומטית כדי להיות מוכן לניתוח פלואורסצנטית (FLR)-MS.הערה: דגימות אלה יציבות כאשר הם מאוחסנים ב-80 ° c לפחות 1 חודש. אחסן את הצלחת HILIC באריזה המקורית שלה, סגור מודבק בתוך desiccator לשימוש עתידי. ניתוח LC-MS של מתויג N-גליקנים לנתח את התווית N-גליקן שכותרתו על מערכת ביצועים כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד בשילוב לגלאי הזריחה ולפי ארבעה הזמן של הטיסה (Q-תוף) ספקטרומטר מסה. השתמש בעמודה המאושרת להפרדת כרומטוגרפית של הגליקנים המסומנים בתווית וחום ל-60 ° צ’ במהלך הפרדות.הערה: יש לרוקן את העמודה עם 60% acetonitrile ו-40% H2O לפני השימוש: 50 קורות חיים לפני השימוש הראשון או 20 קורות החיים אם העמודה כבר בשימוש. השימוש 50 mM אמוניום (AmF) (עשה עם להתרכז שלב נייד) ו 100% LC-MS-כיתה ACN עבור שלבים ניידים. AmF רגיש לשינויי pH והוא שמיש עבור 1 חודש לאחר ערבוב. הגדר את קצב הזרימה הראשונית ל 0.4 mL/min, עם מעבר LC המספק AmF הגוברת במהלך השלב להתחמק. הגדר את גלאי FLR כדי למדוד ב-לשעבר 265/EM 425 ננומטר עם קצב דגימה של 2 Hz. הגדר את Q-תוף למצב רגישות יון חיובי MS1, עם טווח מסה של 100-2000 daltons (Da), זמן סריקה של 0.25 שניות והמשכיות הנתונים הרצף. השתמש לוקיצין enkephalin (2 ng/μL ב 50% ACN/0.1% FA) עבור ההפניה ההמונית הפנימית, במצב “אל תחיל תיקון”.הערה: תיקון ההפניה ההמונית הפנימית יוחל במועד מאוחר יותר במהלך עיבוד נתונים. מחדש להשעות את סולם תוספי ברצף ב 22.5 μl של H2O, 25 μl של dmf ו 52.5 μl של acn. הכינו 10 μL לאחסון ב-80 ° c, מכיוון שהסולם אינו יציב במשך יותר מ -24 שעות בטמפרטורות גבוהות יותר (טמפרטורת החדר, 4 ° c). סולם דטרן מתפעל אחרי יותר ממחזור אחד של ההפשרה. מניחים את הדגימות בדוגם האוטומטי שנקבעו ל-10 ° c. טען בקבוקון של סולם דקטרן יחד עם דגימות, מאחר שפרטי זמן ההחזקה של הסולם ישמשו להקצאות בזמן שהמידע ההמוני המשמש לאימות זהויות. השתמש בזריקות של 10 μL עבור הדגימות וזריקות ה7.5 μL עבור הסולם. . הכנס דגימות בטרילקאט הפעל את השיטה שנטענה. מזהה N-גליקן לנתוני LC-MS לבצע עיבוד נתונים עם תוכנית אופטימיזציה עבור אינטראקציה ידרופילי כרומטוגרפיה המסה של המוני ספקטרומטריה (hilic-flr-MS) נתונים. החל תיקונים פנימיים של הפניות המונים בתוך התוכנית. ציין את הזרקות סולם תוספי כ-“סטנדרטי ” במידע לדוגמה. בשיטת הניתוח, הגדר את זמני ההחזקה של מתחם ההפרדה לאלה של תרכובות הסולם שזוהו במהלך ההפעלה. כדי להבטיח שאזור% יוחזר עבור גליקנים מזוהים, שנה את שיטת הניתוח: תחת הכרטיסיה עיבוד , לחץ על הגדרות כימות הנתונים-כיול וקבע “סוג התאמה של עקומת כיול” ל-“תגובה יחסית (%). 4. ניתוח צבירת נוגדנים באמצעות SEC-דוליטל הכנה לדוגמא העבר את 3.5 mg/mL (שלב 2) חלבון מדולל במבחנה עם הוספת משקה 150 מזכוכית μL. השתמש ג’ל טעינת עצה כדי להפוך את הפעמון התחתון של הכנס כדי למנוע את המבוא של בועות. כסה את הבקבוקון עם כובע הספטטה ולאחר מכן בצע ניתוח מיידי. אחסן ב-4 ° צ’ אם תנתח מאוחר יותר. דוליטל הגדרת תצורה ושיווציההערה: צבירת מנתחים ב-SEC-דוליטל מוגדרת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת לחץ גבוה במיוחד (UHPLC) עם מזהה דוליטל וגלאי מדד השבירה הנשלטים על ידי תוכנת דוליטל. קביעת תצורה של קובץ שיטה בתוכנת UHPLC לשליטה במערכת UHPLC, הגדרת קצב הזרימה ל 0.4 mL/min עם שלב נייד של מלוחים באגירה של 1x פוספט (PBS) (מדולל מ 10x), נפח ההזרקה ל-5 μL, טמפרטורת העמודה עד 25 ° c , ואת גלאי מערך דיודות (אבא) כדי לנטר 280 ננומטר. קבע זמן ריצה ל-20 דקות. לפחות לפני כל ניתוח לדוגמה. הממשק בין UHPLC ו-Multi זווית פיזור אור-מדד השבירה (דוליטל-RI) גלאי דורש שימוש בפלט אנלוגי על אבא. הגדר את הנחת אבא כדי 1,000 מאו בקובץ השיטה אבא ו-AU/UV הגדרה 1 (כלי UV ≫ ערוצים ≫ ערוץ 1). הפעל את המנורה אבא 30 דקות לפני הניתוח ההתחלתי ולהגדיר את אורך הגל כדי 280 ננומטר. במקביל, נקה את תא ההפניה של מדד השבירה (RI) עבור 15 דקות או עד שתוכנית הבסיס יציבה ולאחר מכן סגור את תא ההפניה. קביעת תצורה של רצף התוכנה SEC-דוליטל, הגדרת זמן האיסוף עד 12 דקות, נפח ההזרקה ל-5 μl, ה-dn/dc ל-0.185 ml/g, מקדם הכחדה A280 אם נקבע בעבר או 1.37 ml * (mg * ס”מ)-1, וריכוז ה דוגמה. לחץ על הפעל והמתן עד שתיבת הדו “המתנה להזריק” תופיע על המסך.הערה: מקדם ההשמדה של A280 הוא ספציפי לחלבון הריבית והוא צריך להיות מוגדר לניסויים. הגדר רשימה לדוגמה בתוכנת UHPLC בסדר זהה לזו שבתוכנת דוליטל-RI והגשה.הערה: חשוב להפעיל בדיקת התאמה למערכת לפני ואחרי הפעלה. אלבומין סרום בדרך כלל משמש לבדיקת הרחבת השיא, סימן לכך שהעמודה SEC עשויה להזדקק לניקוי או להחלפה. ניתן להשתמש באותה הזרקת תקן BSA כדי לציין יישור אותות, הרחבת שיא ונרמול גלאי. ניתוח מצטבר באמצעות תוכנת דוליטל לחצו על הפרוצדורות המסומנות בלשונית. ציין את רמת הביטול המינימלית הנדרשת; אף אחד לא מספיק בדרך כלל. ודא שתוכניות בסיסיות צוירו כראוי והתאימו במידת הצורך, לערוצי LS1, LS2, LS3, RI ו-UV. הגדר את אזור השיא של הריבית. סקור את התפלגות המסה המולקולרית כדי לוודא שהפסגות הנקראות מכילות חלקיקים בגודל דומה. 5. ניתוח משתנה מחייב הכנה לדוגמה ותיוג התחל עם 80 μL של פתרון נוגדן mg/mL של 3.5. Desalt המדגם באמצעות 0.5 mL התפלה עמודה (7k MWCO). הכן את העמודה על ידי הצמדה תחילה את הפקק התחתון, ולאחר מכן התרופפה את הפקק העליון, והצבתו בשפופרת מיקרו-1.7 mL. צנטריפוגה את העמודה התפלה עבור 1 דקות ב 1,500 x g.הערה: סמן את החלק החיצוני של העמודה בנקודה כך שניתן יהיה להניחה בכיוון המקורי של השלבים הבאים. העבר את העמודה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה חדשה. הוסף את 80 μL של חלבון מדולל לראש הטור. יישר את העמודה לכיוון המקורי. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,500 x g. הסר את הדגימה מהצנטריפוגה, מחק את העמודה התפלה וערבב היטב את המדגם.הערה: התפלה נדרש רק אם מטריצה המדגם מכילה amines ראשי, ילוי שperturb את האלקטרופורזה במדגם, או חומרים אחרים שאינם תואמים. לדלל את המדגם לריכוז הסופי של 2 מ”ג/mL בנפח של 25 μL ולהוסיף 5 μL של מאגר תיוג (ראה טבלת חומרים: משתנה החיוב ערכת מגיב) בצלחת 96-ובכן. הכינו את התיוג המגיב על ידי דילול הכמות הדרושה של תיוג מגיב (ראה טבלת חומרים: משתנה חיוב ערכה מגיב) 1:30 בדימתילמיד. מודאת המדגם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר הרחק מן האור.הערה: חשוב להפשיר ולאחר מכן להשתמש באופן מיידי זה מגיב ולהשתמש בו בתוך 10 דקות של ערבוב עם DMF. לאחר הדגירה, להוסיף 60 μL של מים בכיתה מגיב ומערבבים היטב על ידי ליטוף. לכסות את הצלחת עם חותם צלחת וצנטריפוגה את הצלחת ב 1,000 x g עבור 1 דקות. הכנת שבב משתנה הטעינה הכינו את שבב משתנה המטען על ידי הסרת פתרון האחסון ושטיפת בארות 1, 3, 4, 7, 8, ו -10 עם מים. לאחר מכן להחליף את המים עם pH 7.2 פועל מאגר (ראה טבלת חומרים: החיוב משתנה ערכת מגיב). הוסף 750 μL של pH 7.2 הפעלת מאגר לתוך צינור המאגר ולמקם את צינור המאגר במקום המצוין בפינה השמאלית העליונה של מגש המדגם. עכשיו להסיר את חותם הצלחת מלוחית 96-ובכן, לחץ על בטל טעינה על ממשק המשתמש במכשיר, והכנס את הצלחת לתוך מגש המדגם gxii.הערה: מאגרי pH 7.2 שימשו לניתוח זה. השימוש ב-pH 5.6-7.2 מאגרים עשוי לשמש בהתאם לחלבון pI. בעת שימוש במאגרי pH נמוכים יותר, ייתכן שיידרשו שעות הפעלה לדוגמה ארוכות יותר. לחץ על לחצן בטל טעינה של שבב בממשק המשתמש. ודא שהאלקטרודות חופשיות מכל החלקיקים, ואם לא, יש לנקות עם מנקי המוך. כאשר מכניס את השבב לוודא כי החלון במרכז השבב הוא ללא חלקיקים או כתמים. אם יש צורך, נקו במטלית רכה ונטולת סיבים.הערה: בעבודה עם שבבי אלקטרופורזה קפידית, הסירו מאגר על ידי שאיפה ואקום, ואחריו התוספת המיידית של הפתרון הבא כדי למנוע מבארות להתייבש. כדי למזער את הקדמה של בועות, לתרגל הפוך טכניקת ליטוף. כאשר הטיפול השבב, להיות מודע של נימי שברירי הארכת מהחלק התחתון של השבב, וודא כי זה לא להתייבש ואינו לשבור דרך טיפול מחוספס. סגור את המכסה אל תא השבב ובחר את הערך של משתנה החיוב בחלבון HT . לחץ על לחצן הפעלה. בצע את ההנחיות כדי לבחור את הבארות לדוגמה, סוג הלוח, זמן הטיפול (68, 90, או 100 s) ושם הקובץ. לחץ על התחל בסוף ההנחיות. ניקוי שבב דורש שטיפת כל טוב 2x עם מים, ואחריו תוספת של מאגר האחסון (ראה טבלת חומרים: המטען מגיב משתנה ערכה). ברגע שאגור במאגר האחסון, החלף את השבב בכלי וכשתתבקש, בחר את הערך של חיוב החלבון HT. במסך הראשי בחר ‘ שטוף ‘ בממשק המשתמש. לאחר השלמתו, להסיר את השבב, לנגב את האלקטרודות עם מים ומנקי מוך, ולאחסן את השבב ב 4 ° c. ניתוח משתנים מגובים פתח את תוכנת ניתוח המכשיר. יבא את ההפעלה על-ידי הולך לקובץ ≫ ייבוא קובץ נתונים… ולחיצה על הקובץ הרצוי *. gxd. רק השם יבוצע על התוכנה, כך שינוי שם הבארות הוא יתרון (כלים ≫ עורך שם לדוגמה). בחר את הקבצים לייצוא על-ידי החזקת מקש shift למטה בעת בחירת הקבצים. לחץ על קובץ ≫ ייצוא. .. ובחר את תיבת הנתונים הגולמיים ולאחר מכן את התיבה תבנית AIA . פתח את הכרטיסיה עיון בפרוייקטים בתוך תוכנת הניתוח. לחץ על מסד נתונים ≫ ייבוא נתונים ובחר את המיוצא *. קבצי CDF. לאחר ייבוא, נווט אל הכרטיסיה זריקות , בחר את הקבצים שנותחו, לחץ לחיצה ימנית ועבור לתהליך.. . בחלון שיצוץ, בחר בתיבת הסימון הסמוכה לתהליך ובחר בתיבת הרדיו “השתמש בשיטת עיבוד שצוינה” ובשיטת העיבוד הרצויה מהתיבה הנפתחת. בתיבה הנפתחת מתחת לתווית “כיצד:” בחר באפשרות כיול ו-קוונטייט. לאחר עיבוד, נווט לכרטיסיה תוצאות ובדוק את השילוב של כרומטוגרמות.הערה: יש לוודא את שיטת העיבוד עבור כל אחת מהשיטות. כנקודת התחלה, הפרמטרים המשמשים עבור שיטת העיבוד הנוכחית נכללים בקובץ ‘ משלים ‘.הערה: ניתן לבצע ייצוא של הנתונים בצורת דוח או לייצא רק את הקוונפיקציה של השיא. אלה יכולים להתבצע באותו זמן כמו עיבוד או מחלון התוצאות. 6. אנליזת חומצת אמינו הגדרת העקומה הסטנדרטית לקוונפיקציה חומצת אמינו מוחלטת על ידי LC-MS להכין את חומצת אמינו מורחבת (EAA) תערובת ידי המסת 59.45 מ”ג של Asn, 59.00 mg של Hyp, 65.77 mg של Gln, ו 91.95 mg של Trp ב 25 מ ל של 0.1 N HCl. הריכוז הסופי של כל חומצת אמינו בתערובת אאה הוא 18 nmol/μL. להכין את התקן הפנימי (ISTD) פתרון מניות על ידי המסת 58.58 מ”ג של צפון ו44.54 mg של Sar ב 50 mL של HCl. להכין את הסטנדרטים חומצות אמינו מלאה על ידי שילוב של הפתרון מלאי חומצות אמינו המכיל Ala, Asp, Arg, Cys, לגלו, בגסות, שלו, איל, Leu, נפגשו, פה, Pro, Ser, מלאו, Trp, וואל ב 1 nmol/μL כל אחד עם תערובת EAA עבור ריכוזי חומצות אמינו 900 הסופי של , 225, 90, 22.5, ו 9 pmol/μL. להוסיף את מלאי ISTD מוכן לסטנדרטים חומצות אמינו לריכוז הסופי של או 90 pmol/μL או 900 pmol/μL כדי ליצור “נמוך” ו-“high” סטנדרטים פנימיים להשתמש כפקדים חיוביים עבור השיטה. מניחים את ריכוזי חומצת האמינו בבקבוקונים לדוגמה בתוך הדגם האוטומטי של הבנק. צור עקומת כיול (9 עד 900 pmol/μL) בתוכנת המכשיר המבוססת על ריכוזי החומצות האמינו באמצעות ההוראות הבאות. השתמש ב-Q-תוף בתרסיס ליינון (ESI) רגישות חיובית מצמידים ל-MC לניתוח של חומצות אמינו שלמות. עבור הפרדה כרומטוגרפית, השתמש בעמודת פאזה רגילה העשויה עבור הפרדות של חומצת אמינו. הכינו את המאגרים הבאים עם ריאגנטים המוני כיתות המסה: A = acetonitrile + 0.1% החומצה פורמית ו-B = 100 mM אמוניום. הגדר את קצב הזרימה מסוג LC ל-0.6 mL/min וטמפרטורת עמודה ל-40 ° c. השתמש בתנאי הדרגתי הבאים של 15 דקות עבור הפרדות של חומצות אמינו: 14% B (0-3 דקות), 14-100% B (3-10 דקות), 100% B (10-13 דקות), 100-8% B (13-14 דקות), 8% B (14-15 דקות). השתמש ברישומי העמודות “סוג לדוגמה” ו-“Conc A” בתוכנית הרכישה של MS כדי ליצור עקומת כיול לניתוח עתידי של מדיה ביוריאקטור גסה בתוכנית הקוונטור. כדי לגרום לעמודות אלה להופיע בתוכנית הרכישה, השתמש בפקודה התאמה אישית של הצג. … סוג המדגם לתקני חומצת האמינו יהיה “סטנדרטי” בזמן שדגימות המדיה יהיו “אנליטה”. מלא את העמודה “Conc A” עם הריכוזים המספריים של התקנים ביחידות הנדרשות (ex: pmol/μL). הפעל את ריכוזי החומצות האמינו המוכנות לפחות פעמיים. ודא שכלי ה-, וספקטרומטר המסה פועלים כראוי על-ידי בדיקת פסגות ה-ISTD. השתמש באפשרות “ערוך שיטה” ביישום הקוונ, כדי ליצור את שיטת הקוונ, (קובץ *. mdb). הגדר את כל חומצות האמינו המעניינות ביישום כימות, כגון שם המתחם, ערך m/z וזמן השמירה הצפוי. שנה את פרמטרי השילוב עבור השיטה כאן. השתמש בשיטת חומצת האמינו שנוצרה בדגימות הסטנדרטיות כדי ליצור את עקומת הכיול. ניתן לייצא עיקול זה לקובץ *. cdb לשימוש עם דגימות המדיה באמצעות הפקודה ‘ ייצוא > כיול. .. ביישום כימות הדרך, שמור את הפריסה הרצויה לקובץ *. qlt כדי להחיל על ערכות נתונים עתידיות באמצעות “שמירת פריסה כ…”. שם (שם הזרקה), אזור ו-Conc הם עמודות הפלט החשובות ביותר. חומצות אמינו בדיקת מדיה ביוריאקטור גולמי על ידי LC-MS צנטריפוגה גולמי מדיה ביוריאקטור חקן ב 1,962 x g עבור 5 דקות ולעבור דרך מסנן 0.22 יקרומטר. מעקב עם perchloric חומצה ניקוי להסיר חומר חלבון וחלקיקים: לערבב את מדיה מסוננים ביוריאקטור חקן עם 0.4 N hclo4 ביחס 1:1 וצנטריפוגה ב 14,700 x g עבור 5 דקות ב-RT. לאסוף את המדיה הבהירה בבקבוקונים דוגם אוטומטי.הערה: כוונן את עוצמת ההזרקה לפי הצורך כדי להפוך את ריכוזי חומצת האמינו לנופלים בטווח הכיול. בהתאם לכלי, נפח ההזרקה ניתן לכוונן בין 0.1 μL ו-10 μL. הפעל דגימות מדיה בטריליטה על-ידי LC-MS. השתמש ב”דגימות תהליך” תחת תוכנית הקוונט יחד עם השיטה (*. mdb) וקובץ הכיול (*. cdb). השיטה ועקומת הכיול יוחלו באופן אוטומטי על דגימות המדיה הגולמי על-ידי יישום הקוונ, ברגע שכל הזריקות יושלמו. כדי לייצא נתונים לצורך ניתוח בתוכנית אחרת (כגון גיליון אלקטרוני), השתמש בפקודה “Print” וצור קובץ *. xps או *. pdf.