Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

1. zuivering van antilichamen Opmerking: de evenwichts buffer voor het in-House antilichaam is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. De gebruikte elutie buffer is 0,1 M azijnzuur. De buffers en hars (proteïne A) zijn afhankelijk van het specifieke antilichaam gezuiverd. Kolom volume is gelijk aan de Bedhoogte van de hars. De hoeveelheid mobiele fase wordt bepaald in termen van kolom volume. Het zuiveringssysteem initialiseren Open de software die aan het zuiveringssysteem is gekoppeld. Gebruik handmatige instructies om de kolom met de equilibratie buffer met een debiet van 2 mL/min voor 40 min. Stop de handmatige uitvoering na equilibratie. In de breuk Collector, plaats 15 mL conische buizen voor het verzamelen van gezuiverde antilichaam eluaat en 50 mL conische buizen om doorstroming te verzamelen tijdens hoge zout spoeling. Zorg ervoor dat de breuk collector wordt teruggezet naar de beginpositie door het openen en sluiten van de breuk Collector vóór het begin van de uitvoering. De breuk collector wordt op 7 °C gehouden.Opmerking: de breuk Collector kan handmatig worden gereset onder de breuk Collector tab in instellingen, voor zowel 15 ml en 50 ml buizen. Monster injectieOpmerking: de geoogste celkweek vloeistof die in de volgende procedures wordt gebruikt, is verkregen uit ovariumcellen van Chinese Hamster, gekweekt in geautomatiseerde micro-bioreactoren9. Voeg de 0,22 μm gefilterde oogst celkweek vloeistof toe aan een lege injectiespuit van 12 mL waarvan het uiteinde van de nozzle is afgedekt. Houd de spuit met de nozzle naar beneden gericht en plaats de zuiger van de spuit tot een klein deel van de zuiger in. Om ervoor te zorgen dat de vloeistof niet lekt, draai de spuit met de nozzle naar boven gericht en verwijder de dop. Houd de spuit nog steeds met de nozzle naar boven gericht en duw de cilinder om lucht te verdrijven totdat de celkweek vloeistof zich aan de punt van het mondstuk bevindt. Plaats het mondstuk van de spuit in de handmatige injectie poort op het zuiveringssysteem en draai om vast te draaien. Duw de zuiger naar beneden totdat al het monster is geïnjecteerd en zichtbaar is in de bijgevoegde 10 mL grote volume monster lus. Open het bestand met de opgeslagen methode. Sla het resultaat bestand op de gewenste locatie op en geef de bestandsnaam op wanneer hierom wordt gevraagd. Hit Run nadat het monster is geïnjecteerd in de grote volume sample lus. Het uitvoeren van de zuiveringsmethode Selecteer de opgeslagen methode en klik op uitvoeren wanneer dit wordt gevraagd door instrument software (stap 1.2.5).Opmerking: het systeem is ingesteld om de volgende stappen uit te voeren. De gebruiker hoeft niets te doen terwijl het instrument actief is. De kolom met drie kolom volumes (CVs) van een evenwichts buffer met een debiet van 2 mL/min. Zodra de kolom is geëscaleerd, zal het systeem, met behulp van de grote volume-lus, het monster op de kolom injecteren met een debiet van 1 mL/min. Een daling van het UV-signaal bij 280 nm geeft aan dat het monster klaar is met laden. Was de kolom met een evenwichts buffer met een debiet van 2 mL/min tot het UV-signaal daalt tot beneden 25 mAU. Gebruik vier Cv’s van 25 mM tris met 1 M NaCl bij pH 7,5 om een secundaire hoge zout spoeling uit te voeren met een debiet van 2 mL/min. De systeem breuk Collector verzamelt elk eiwit/DNA dat uit de kolom komt tijdens de zout spoeling in 50 mL buizen. Breng vijf Cv’s van de elutie buffer aan met een debiet van 1 mL/min om het antilichaam van de kolom te elueren. Verzamel het eluaat in buizen van 15 mL op basis van UV-signaal; Wanneer het UV 280-signaal boven 35 mAU ligt, begint de collectie; de collectie eindigt wanneer het signaal daalt tot onder 50 mAU; Dit wordt Peak Cutting genoemd.Opmerking: piek zagen zorgt voor normalisering van elutie profielen en om elutie pieken te voorkomen die eiwit aggregaten24kunnen bevatten. Was de kolom met drie Cv’s van de equilibratie buffer. De run eindigt na de Wash stap. Na het elutie onmiddellijk het gezuiverde eiwit neutraliseren met behulp van 1 M Tris-basis tot een pH van ~ 5,5. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een microvolume UV-VIS spectrofotometer bij 280 nm en 260 nm en bewaar bij 4 °C. Concentreer het gezuiverde antilichaam met behulp van centrifugale eenheden (stap 2). Onderwerp vervolgens de gezuiverde antilichaam aan ontwikkelen analyse met behulp van LC-MS en na aggregatie profiel analyseren met behulp van SEC-MALS (stap 3 & 4).Opmerking: het gezuiverde antilichaam mag niet worden bevroren zonder verdere buffer uitwisseling, aangezien frequente vries dooi cycli aggregatie en neerslag kunnen veroorzaken. 2. concentratie van gezuiverd antilichaam Opmerking: de Tris-acetaatbuffer is 0,1 M azijnzuur geneutraliseerd met 1 M Tris-basis tot een pH van ~ 5,5. Plaats 100 kDa-filters in centrifugebuizen. Was de filters met 500 μL dubbel gedestilleerd water. Centrifugeer 10 min bij 14.000 x g bij kamertemperatuur (RT). Herhaal deze stap twee keer. Gooi het filtraat weg. Breng de gesposeerde filters over naar verse centrifugebuizen en voeg aan elk filter 500 μL monster toe. Centrifugeer 10 min bij 14.000 x g. Keer het filter om in een nieuwe spin Tube. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g om het geconcentreerde monster te verzamelen. Bepaal de monsterconcentraties met een UV/VIS-spectrofotometer. Leeg de spectrofotometer met behulp van een oplossing van tris-acetaatbuffer. Gebruik een eiwit extinctiecoëfficiënt van 1,37 mL • (mg • cm)-1 bij 280 nm voor een 1% (% m/v) IgG oplossing. Gebruik het geconcentreerde monster om 12,5 μL van 2 mg/ml werkoplossing voor ontwikkelen-analyse en 30 μL 3,5 mg/ml werkoplossing voor SEC-MALS te bereiden.Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. De monsters moeten worden gekoeld bij 4 °C. Bij een concentratie van 2 mg/mL moeten deze monsters gedurende ten minste drie maanden stabiel zijn bij 4 °C, terwijl hogere concentraties kunnen neerslaan. 3. analyse van N-glycans met behulp van massa spectroscopie N-Glycan labeling en isolatie Begin met antilichaamconcentraties van 2 mg/mL in een geschikte buffer, zoals neutraal natriumfosfaat, citraat of HEPES-buffer. Bereid een intacte mAb-standaard (zoals NIST mAb) op 2 mg/mL samen om de experimentele monsters te verwerken om als een positieve controle te dienen.Opmerking: de antilichamen moeten in een uiteindelijke buffer staan met geen SDS en minder dan 0,1 mM nucleofielen (zoals Tris, DTT, glycine of histidine). SDS in de monster buffer moet worden verwijderd. Als nucleofielen zich in de buffer bevinden, verdunnen ze dan of voeren ze een buffer uitwisseling uit, omdat ze de kit zullen verstoren. Het algemene protocol is voorzien van de ontwikkelen Kit. Verdun 7,5 μL van de antilichamen met 15,3 μL LC-MS-kwaliteit water in buizen van 1 mL die met de kit worden meegeleverd en breng vervolgens denatureren met 6 μL 5%-oplossing van een enzym vriendelijke en MS-vriendelijke oppervlakteactieve stof bij 90 °C gedurende 3 minuten. Laat de monsters 3 minuten afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Voeg vervolgens 1,2 μL PNGase F toe en inincuberen gedurende 5 min bij 50 °C. Na het koelen van 3 min naar RT, label de gecleaved N-glycans door het toevoegen van 12 μL fluorescerende tagging reagens opgelost in watervrij dimethylformamide (DMF) en wacht 5 min. Verdun het gelabelde N-glycan mengsel met 358 μL acetonitril (ACN). Plaats een hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) plaat in een vacuüm spruitstuk met shims en afvalbak. Gebruik een multikanaalspipet voor grote aantallen samples. Conditioner de putten met 200 μL water, waar het vacuüm wordt afgesteld, zodat de vloeistof 15-30 s zal nemen om door de HILIC hars te gaan. Met 200 μl van 85% ACN voorafgaand aan het laden van het met ACN verdunde gelabelde ontwikkelen-mengsel (400 μl), waarbij het vacuüm wordt toegepast nadat elke nieuwe vloeistof aan de putjes is toegevoegd. Was de hars met 600 μL van 1% mierenzuur (FA)/90% ACN tweemaal. Vervang de afvalbak met 600 μL opvang buizen. Elute de gelabelde N-glycans met SPE elutie buffer (3 eluties van 30 μL per stuk) in de opvang buizen. Verdun de samengevoegde eluties met 310 μL DMF/ACN-monster verdunningsmiddel. Pipetteer de monsters in autosampler flesjes om klaar te zijn voor de fluorescentie (FLR)-MS analyse.Opmerking: deze monsters zijn stabiel wanneer ze gedurende ten minste 1 maand bij-80 °C worden bewaard. Bewaar de HILIC plaat in de originele verpakking, dichtgeplakt en in een exsiccator voor toekomstig gebruik. LC-MS-analyse van gelabelde N-glycans Analyseer de gelabelde N-glycan elutie samples op een Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systeem gekoppeld aan een fluorescentiedetector en quadrupool time-of-Flight (Q-ToF) massaspectrometer. Gebruik een kolom die is goedgekeurd voor chromatografische scheiding van de gelabelde glycanen en verwarm tot 60 °c tijdens scheidingen.Opmerking: de kolom moet worden gespoeld met 60% acetonitril en 40% H2O vóór gebruik: 50 cv’s vóór het eerste gebruik of 20 cv’s als de kolom eerder is gebruikt. Gebruik 50 mm ammonium formiaat (AMF) (gemaakt met mobiel fase concentraat) en 100% LC-MS-grade ACN voor de mobiele fasen. De AmF is gevoelig voor pH-veranderingen en is bruikbaar gedurende 1 maand na het mengen. Stel de initiële stroomsnelheid in op 0,4 mL/min, met de LC-gradiënt die tijdens de elutie fase een toenemende AmF biedt. Stel de FLR-detector in op EX 265/EM 425 nm met een bemonsteringsfrequentie van 2 Hz. Stel de Q-ToF in op de modus voor positieve Ion-gevoeligheid van de vraag, met een massa bereik van 100-2000 Daltons (da), een scantijd van 0,25 seconden en Continuum-gegevensverzameling. Gebruik Leucine enkephalin (2 ng/μL in 50% ACN/0.1% FA) voor de interne massa referentie, in de modus “niet toepassen correctie”.Opmerking: de interne massa referentie correctie wordt later toegepast tijdens de gegevensverwerking. Onderbreek de dextran-ladder opeenvolgend in 22,5 μL van H2O, 25 ΜL DMF en 52,5 μL ACN. Bereid 10 μL aliquots voor opslag bij-80 °C, aangezien de ladder niet meer dan 24 uur stabiel is bij hogere temperaturen (kamertemperatuur, 4 °C). De dextran-ladder degradeert na meer dan één vries-dooi cyclus. Plaats de samples in de autosampler ingesteld op 10 °C. Laad een injectieflacon met dextran-ladder samen met monsters, omdat de retentietijd-informatie van de ladder wordt gebruikt voor opdrachten, terwijl de massa-informatie die wordt gebruikt om identificaties te valideren. Gebruik 10 μL injecties voor de monsters en 7,5 μL injecties voor de ladder. Injecteer monsters in drievlaat. Voer de geladen methode uit. N-Glycan-identificatie voor LC-MS-gegevens Voer gegevensverwerking uit met een programma dat is geoptimaliseerd voor hydrofiele interactie chromatografie fluorescentie Mass spectrometrie (HILIC-FLR-MS) gegevens. Interne massa referentie correcties binnen het programma toepassen. Wijs de dextran ladder injecties aan als “standaard” in de voorbeeld informatie. In de analysemethode, stel de scheiding samengestelde retentietijden aan die van de ladder verbindingen die werden gedetecteerd tijdens de run. Om ervoor te zorgen dat Area% wordt geretourneerd voor geïdentificeerde glycans, wijzigt u de analysemethode: Klik onder het tabblad processing op Kwantatie-instellingen -Kalibreer en stel “kalibratiecurve passend type” in op “relatieve respons (%)”. 4. analyse van antilichaam aggregatie met SEC-MALS Monstervoorbereiding Breng de 3,5 mg/mL (stap 2) verdunde eiwitten over in een injectieflacon met een glazen wisselplaat van 150 μL. Gebruik een gel loading tip om te pipet in de onderste Bel van de INSERT om te voorkomen dat de invoering van bubbels. Dop de injectieflacon met een septa dop en analyseer onmiddellijk. Bewaren bij 4 °C als u later analyseert. Configuratie van SEC-MALS en equilibratieOpmerking: Analyseer aggregatie op SEC-MALS die is geconfigureerd met een ultra hogedrukvloeistofchromatografie (UHPLC) met een MALS-detector en een brekings index-detector die wordt aangestuurd door de MALS-software. Configureer een methode bestand in de UHPLC-software voor de besturing van het UHPLC-systeem, waarbij de stroomsnelheid wordt ingesteld op 0,4 mL/min met een mobiele fase van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (verdund van 10x), het injectievolume tot 5 μL, de kolomtemperatuur tot 25 °C en de diode array detector (DAD) om 280 nm te bewaken. Stel de uitvoeringstijd in op 20 min. het systeem wordt gedurende ten minste 4 uur op een bepaald moment vóór de analyse van het monster ingesteld. De interface tussen UHPLC en multi angle lichtverstrooiing-refractive index (MALS-RI) detectoren vereist het gebruik van de analoge uitgang op de vader. Stel de DAD demping in op 1.000 mAU in het DAD Method bestand en AU/UV-instelling op 1 (UV-instrument ≫ kanalen ≫ kanaal 1). Zet de DAD lamp 30 min vóór aanvang van de analyse aan en stel de golflengte in op 280 nm. Op hetzelfde moment, de refractive index (RI) referentiecel verwijderen voor 15 min of totdat de basislijn stabiel is en sluit vervolgens de referentiecel. Configureer de reeks SEC-MALS software, stel de afhaaltijd in op 12 minuten, het injectievolume tot 5 μL, de DN/DC tot 0,185 mL/g, A280 extinctiecoëfficiënt indien eerder experimenteel bepaald of tot 1,37 mL * (mg * cm)-1, en de concentratie van de Monster. Klik op uitvoeren en wacht tot het dialoogvenster ‘ wachten om te injecteren ‘ op het scherm wordt weergegeven.Opmerking: de A280 extinctiecoëfficiënt is specifiek voor het eiwit van belang en moet experimenteel worden bepaald. Configureer een voorbeeld lijst in de UHPLC-software in dezelfde volgorde als in de MALS-RI-software en dien deze in.Opmerking: het is belangrijk om een systeem geschiktheidscontrole voor en na een run uit te voeren. Boviene serumalbumine wordt meestal gebruikt om te controleren op piek verbreding, een teken dat de SEC-kolom moet worden gereinigd of vervangen. Dezelfde BSA standaard injectie kan worden gebruikt om de signaal uitlijning, piek verbreding en detector normalisatie op te geven. Statistische analyse met MALS-software Klik op het tabblad gemarkeerde procedures. Specificeer het minimumniveau van ontspiking vereist; geen van beide is meestal voldoende. Controleer of de basislijnen op de juiste wijze zijn getekend en stel deze zo nodig in voor LS1-, LS2-, LS3-, RI-en UV-kanalen. Stel het piek gebied in. Controleer de moleculaire massaverdeling om te bevestigen dat de opgeroepen pieken deeltjes van vergelijkbare grootte bevatten. 5. charge-variant analyse Monstervoorbereiding en etikettering Begin met 80 μL van een oplossing van 3,5 mg/mL antilichamen. Ontzout het monster met een ontzilting kolom van 0,5 mL (7k MWCO). Bereid de kolom voor door het eerst van de onderste stop te snappen, vervolgens de bovenste stop los te maken en deze in een micro centrifugebuis van 1,7 mL te plaatsen. Centrifugeer de ontdesalting kolom gedurende 1 minuut bij 1.500 x g.Opmerking: Markeer de buitenkant van de kolom met een punt zodat deze in de oorspronkelijke richting voor de volgende stappen kan worden geplaatst. Breng de kolom over naar een nieuwe micro centrifugebuis. Voeg de 80 μL verdund eiwit toe aan de bovenzijde van de kolom. De kolom uitlijnen met de oorspronkelijke afdrukstand. Centrifugeer 2 min bij 1.500 x g. Verwijder het monster uit de centrifuge, gooi de ontdesalting kolom weg en meng het monster goed.Opmerking: Desalting is alleen vereist als de monstermatrix primaire aminen bevat, hulpstoffen die de monster elektroforese of andere onverenigbare stoffen zullen pertureren. Verdun het monster tot een eindconcentratie van 2 mg/mL in een volume van 25 μL en voeg 5 μL van de etiketterings buffer toe (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit) in de 96-well plate. Bereid het etiketterings reagens door de benodigde hoeveelheid etiketteer reagens te verdunen (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit) 1:30 in dimethylformamide. Incuberen het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, weg van het licht.Opmerking: het is belangrijk om dit reagens te ontdooien en vervolgens onmiddellijk te gebruiken en het binnen 10 minuten na menging met DMF te gebruiken. Voeg na incuberen 60 μL reagens kwaliteit water toe en meng goed door pipetten. Bedek de plaat met een plaat afdichting en centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 1 minuut. De charge-variant chip voorbereiden Bereid de charge-variant chip voor door de opslagoplossing te verwijderen en Wells 1, 3, 4, 7, 8 en 10 met water te wassen. Vervang dan het water met pH 7,2 lopende buffer (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit). Voeg 750 μL pH 7,2 lopende buffer toe aan de buffer buis en plaats de buffer buis op de aangegeven plaats in de linkerbovenhoek van de monsterhouder. Verwijder nu de plaat afdichting van de 96-goed plaat, druk op de ontlaad plaat op de gebruikersinterface van het instrument en steek de plaat in de gxii-monsterhouder.Opmerking: voor deze analyse werden pH 7,2-buffers gebruikt. afhankelijk van de proteïne-pI kunnen pH 5.6-7.2 buffers worden gebruikt. Bij het gebruik van lagere pH-buffers kan het voorkomen dat er langere looptijden nodig zijn. Druk op de knop ontlaad chip op de gebruikersinterface. Zorg ervoor dat de elektroden vrij zijn van eventuele deeltjes, en zo niet, reinig met een pluisvrij wattenstaafje. Bij het inbrengen van de chip zorg ervoor dat het venster in het midden van de chip vrij is van deeltjes of vlekken. Reinig indien nodig met een pluisvrije, zachte doek.Opmerking: wanneer u werkt met capillaire elektroforese chips, verwijder buffer door vacuüm aspiratie, gevolgd door de onmiddellijke toevoeging van de volgende oplossing om te voorkomen dat putten uitdrogen. Om de introductie van bubbels te minimaliseren, oefen omgekeerde pipetteertechniek. Let bij het hanteren van de chip op het fragiele capillair dat zich uitstrekt van de bodem van de chip, en zorg ervoor dat het niet uitdroogt en niet doorbreekt met ruwe behandeling. Sluit de deksel naar de spaan kamer en selecteer de HT eiwit charge variant assay. Klik op de knop uitvoeren . Volg de aanwijzingen om de monster putten, het plaat type, de testtijd (68, 90 of 100 s) en de bestandsnaam te selecteren. Klik op Start aan het einde van de prompts. Spaan opruiming vereist het wassen van elk goed 2x met water, gevolgd door de toevoeging van opslag buffer (Zie tabel met materialen: Charge variant reagens Kit). Eenmaal in opslag buffer, vervang de chip in het instrument en, wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u de HT proteïne charge assay. Selecteer op het hoofdscherm wassen op de gebruikersinterface. Eenmaal voltooid, verwijder de chip, veeg de elektroden met water en een pluisvrij wattenstaafje, en bewaar de chip bij 4 °C. Analyse van charge-variant Open de instrumentanalyse software. Importeer de uitvoeren door te gaan naar bestand ≫ gegevensbestand te importeren… en op het gewenste *. gxd-bestand te klikken. Alleen de naam wordt overgedragen naar software, dus het hernoemen van de Wells is voordelig (Tools ≫ sample name editor). Selecteer de bestanden die u wilt exporteren door SHIFT ingedrukt te houden terwijl u de bestanden selecteert. Klik op bestand ≫ exporteren… en selecteer de onbewerkte gegevens vak en vervolgens de Aia-indeling vak. Open het tabblad Browse projecten in de analyse software. Klik op database ≫ gegevens importeren… en selecteer de geëxporteerde *. CDF-bestanden. Eenmaal geïmporteerd, navigeer naar de injecties tab, selecteer de bestanden worden geanalyseerd, klik met de rechtermuisknop en ga naar proces… Schakel in het venster dat verschijnt het selectievakje naast verwerken in en selecteer het keuzevakje ‘ gespecificeerde verwerkingsmethode gebruiken ‘ en de gewenste verwerkingsmethode in de vervolgkeuzelijst. In de vervolgkeuzelijst direct onder gelabeld “How:” Selecteer kalibreren en Quantitate. Na verwerking navigeert u naar het tabblad resultaten en controleert u de integratie van de chromatogrammen.Opmerking: de verwerkingsmethode moet voor elke methode worden geverifieerd. Als uitgangspunt worden de parameters die worden gebruikt voor de huidige verwerkingsmethode opgenomen in het aanvullende bestand.Opmerking: het exporteren van de gegevens kan worden gedaan in de vorm van een rapport of alleen de piek kwantificering kan worden geëxporteerd. Deze kunnen worden uitgevoerd op dezelfde tijd als de verwerking of in het resultatenvenster. 6. aminozuuranalyse De standaard curve instellen voor absolute aminozuur kwantificering door LC-MS Bereid het verlengde aminozuur mengsel (EAA) door het oplossen van 59,45 mg ASN, 59,00 mg HYP, 65,77 mg GLN en 91,95 mg TRP in 25 mL 0,1 N HCl. De uiteindelijke concentratie van elk aminozuur in het EAA-mengsel is 18 nmol/μL. Bereid de interne standaard (ISTD) stockoplossing voor door het oplossen van 58,58 mg NVA en 44,54 mg SAR in 50 mL HCl. Bereid de volledige aminozuur normen door de aminozuur voorraadoplossing te combineren met Ala, ASP, ARG, CYS, Glu, gly, his, Ile, Leu, met, PHE, Pro, ser, thr, TRP, Tyr, val bij 1 nmol/μL, elk met het EAA mengsel voor de uiteindelijke aminozuur concentraties van 900 , 225, 90, 22,5 en 9 pmol/μL. Voeg de bereide ISTD-kolf toe aan de aminozuur normen voor een uiteindelijke concentratie van ofwel 90 pmol/μL of 900 pmol/μL om “lage” en “hoge” interne normen te creëren die als positieve controles voor de methode moeten worden gebruikt. Plaats de aminozuur concentraties in monster flesjes in de autosampler van de UPLC. Genereer een ijkcurve (9 tot 900 pmol/μL) in de instrument software op basis van de aminozuur standaardconcentraties aan de hand van de volgende instructies. Gebruik de Q-ToF in de positieve gevoeligheids modus voor elektro spray ionisatie (ESI) gekoppeld aan een UPLC voor intacte aminozuuranalyse. Gebruik voor chromatografische scheiding een normale fase kolom die is gemaakt voor aminozuur separaties. Bereid de volgende buffers met massaspectrometrie kwaliteit reagentia: A = acetonitril + 0,1% mierenzuur en B = 100 mM ammonium formaat. Stel de LC-stroomsnelheid in op 0,6 mL/min en kolomtemperatuur tot 40 °C. Gebruik de volgende verloop condities van 15 minuten voor aminozuur separaties: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min). Gebruik de kolom vermeldingen ‘ sample type ‘ en ‘ conc A ‘ in het MS Acquisition-programma om een kalibratiecurve te maken voor toekomstige analyse van ruwe bioreactor media in het quantitatie programma. Als u wilt dat deze kolommen worden weergegeven in het verwervings programma, gebruikt u de opdracht scherm aanpassen… wanneer u met de rechtermuisknop op de bovenste menubalk klikt. Het type monster voor de aminozuur normen zal “standaard” zijn, terwijl de media samples “analyt” zullen zijn. Vul de kolom “conc A” in met de numerieke concentraties van de normen in de vereiste eenheden (bijv.: pmol/μL). Voer de voorbereide aminozuur standaardconcentraties ten minste tweemaal uit. Valideer dat het UPLC-instrument en de massaspectrometer goed werken door de ISTD-pieken te controleren. Gebruik de optie methode bewerken in de kwantatie toepassing om de kwantatie methode (*. mdb-bestand) te maken. Definieer alle aminozuren van belang in de kwantitatie toepassing, zoals de samengestelde naam, de m/z-waarde en de verwachte retentietijd. Wijzig de integratieparameters voor de methode hier. Gebruik de gemaakte aminozuur methode op de standaard samples om de kalibratiecurve te maken. Deze curve kan worden geëxporteerd naar een *. cdb-bestand voor gebruik met de mediavoorbeelden met de opdracht Export ≫ Calibration… Sla in de toepassing quantitatie de gewenste indeling op in een *. QLT-bestand om toe te passen op toekomstige gegevenssets met “Save layout as…”. Naam (injectie naam), gebied en conc zijn de belangrijkste uitvoerkolommen. Aminozuuranalyse van ruwe bioreactor media door LC-MS Centrifugeer ruwe bioreactor-media bij 1.962 x g gedurende 5 minuten en door een 0,22 μm-filter. Follow-up met perchloorzuur opruimen om eiwitten en fijnstof te verwijderen: Meng de gefilterde bioreactor-media met 0,4 N HClO4 bij een 1:1-verhouding en centrifugeer bij 14.700 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verzamel de geklaarde media in injectieflacons met autosampler.Opmerking: pas het injectievolume zo nodig aan om de aminozuur concentraties binnen het kalibratie bereik te laten vallen. Afhankelijk van het instrument kan het injectievolume worden afgesteld tussen 0,1 μL en 10 μL. Voer mediavoorbeelden uit in drievoud door LC-MS. gebruik “Process samples” onder het quantitatie programma samen met de methode (*. mdb) en het kalibratie bestand (*. cdb). De methode en kalibratiecurve zullen automatisch worden toegepast op de ruwe media monsters door de kwantitatie toepassing zodra alle injecties zijn voltooid. Als u gegevens wilt exporteren voor analyse in een ander programma (zoals een werkblad), gebruikt u de opdracht ‘afdrukken’ en maakt u een *. XPS-of *. PDF-bestand.