Separando as bactérias por cápsula quantidade usando um gradiente descontínuo de densidade

Nota: Certifique-se de que quaisquer avaliações de risco aplicáveis para as cepas bacterianas são seguidas quando cultivo e manipulação de amostras. Esteja ciente de que a criação de uma só vez gradientes demais pode levar a perturbações músculo-esqueléticas devido à pressão nas articulações da pipetagem lento envolvidas. Plano de trabalho e tomar precauções para evitar ferimentos. 1. preparação de estirpes bacterianas ou bibliotecas mutantes Raia para fora as tensões de ser testado em placas de ágar apropriado. Estas são placas de estoque para o experimento. Incube as placas durante a noite na temperatura desejada para atingir o única colônias. Para este experimento,, cultura K. pneumoniae (cepas NTUH-K2044 e ATCC43816) em ágar de caldo (LB) de Luria a 37 ° C e S. pneumoniae (23F selvagem tipo e 23F Δcps) em gelose de sangue em uma jarra de vela umidificado a 37 ° C. Escolha uma única colônia de uma placa de estoque (etapa 1.1) para inocular 10 mL de caldo apropriado usando um loop estéril ou palito de cocktail. Para a seleção das bibliotecas mutantes aleatórias, inocule o caldo com 10 µ l do estoque da biblioteca mutante aleatório (TraDIS biblioteca). Incubar as cepas de K. pneumoniae em baixo sal LB mídia a 37 ° C, com agitação e cepas de S. pneumoniae em meio cérebro coração (BHI) de infusão, estaticamente a 37 ° C. Transferi a cultura durante a noite para um tubo de 15 mL e centrifugar em uma centrífuga de bancada para 10 min a 3.200 x g em andamento fora baldes com inserções de tubo de 15 mL e tampas apertadas de aerossol. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x.Nota: Descarte do sobrenadante através a rota resíduos biológica líquida apropriada no laboratório. O propósito das etapas de centrifugação e ressuspensão (1.2.2 e 1.2.3) é a concentração de bactérias para fácil visualização do gradiente. Culturas bacterianas podem ser carregadas diretamente sobre o gradiente se preferirem. Fortemente capsuladas cepas não podem formar um pellet apertado. Se isso ocorrer, remover o sobrenadante tanto quanto possível sem remover quaisquer células bacterianas, adicionar um volume final de 5 mL 1X PBS e resuspenda o pellet. Continue o protocolo com passo 1.2.5. Para as cepas não-mucoides, vá para a etapa 2. Os tubos de centrifuga, conforme descrito na etapa 1.2.2. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2 mL de 1X PBS. As células estão agora prontas para usar.Nota: A densidade da suspensão de células bacterianas não é crítica, mas deve ser suficiente para visualização no gradiente. Um mínimo de OD600 (densidade óptica em 600 nm) de 4 é sugerido. 2. preparação de diluições de gradientes e gradiente mini teste Prepare diluições gradientes.Nota: Concentrações exatas de médio gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) necessárias as gradientes de densidade para alcançar boa separação serão diferente dependendo das condições de crescimento e estirpe bacterianas usadas. Mini gradiente testes são realizados em primeiro lugar, para identificar as concentrações que darão a melhor separação. Estas incluem a 500 µ l de uma única diluição em um tubo de 2 mL. Se as bactérias serão extraídas o gradiente e repicagem para aplicações a jusante, estas etapas devem ser executadas sob condições assépticas. Combine o médio gradiente de densidade com 1X PBS para fazer as diluições de gradiente de densidade. Faça diluições de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% e 80% (por exemplo,, 2 mL de densidade gradiente médio mais 8 mL de 1X PBS = 10 mL de 20% médio gradiente de densidade). Alíquota 500 µ l da diluição de gradiente de 20% em um tubo de 2 mL para cada tensão a ser testado (por exemplo,, 4 estirpes = 4 tubos contendo 500 µ l da diluição de gradiente de 20%). Repita a etapa 2.1.2 para o resto de diluições do gradientes. Aplicam-se as bactérias para o gradiente. Aplicam-se 100 µ l de células bacterianas, preparado em passos 1.2.3 e 1.2.6 a parte superior de cada diluição gradiente seguindo os passos abaixo. Ocupam-se 100 µ l de células usando uma pipeta de 200 µ l e coloque a ponta da pipeta no lado do tubo logo abaixo do menisco do gradiente mini. Aspire as células bacterianas em gradiente extremamente lentamente, para que eles formam uma camada na parte superior do gradiente, sem qualquer mistura de interface. Repita os passos 2.2.1.1–2.2.1.2 para todas as estirpes a ser testado. Usando um rotor de ângulo fixo com tampa um aerossol, centrifuga os tubos preparados numa microcentrifuga por 10 min a 8.000 x g. Após a centrifugação, transferi os tubos a uma cremalheira para visualizar a diluição de gradiente mínima necessária para manter células apenas acima da camada gradient após centrifugação. Se os resultados não são claros, repita o teste gradiente mini com incrementos de 5% de densidade gradiente médio as diluições acima e abaixo as concentrações definidas no passo 2.1.1 (por exemplo,, 25% e 35% diluições devem ser testadas se o resultado em 30% é ambíguo).Nota: Ver Figura 2para resultados típicos numa diluição médio gradiente de densidade simples . Use os resultados de 2.2.3–2.2.4 passos para determinar as diluições gradientes ideais para usar para separar as células em gradientes descontínuos de larga escala. 3. preparação de células para o experimento principal Prepare-se fresco durante a noite culturas inocular 10 mL de caldo apropriado conforme descrito na etapa 1.2. Incube as culturas durante a noite, em condições apropriadas, conforme descrito na etapa 1.2.1. Pelota a cultura durante a noite, conforme descrito na etapa 1.2.2. Lave as células conforme descrito na etapa 1.2.3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de 1X PBS. Se a tensão não pelota facilmente e é mucoides, resuspenda o pellet em até 2 mL de PBS ou mídia residual. As células estão agora prontas para usar. 4. preparação de gradientes de densidade descontínuos Nota: Um método alternativo de preparação gradiente de fundo (concentrado) ao topo (menos concentrada) utilizando uma pipeta é descrito na etapa 7. Pipetar 1 mL da diluição de gradiente de densidade mais diluída em um polipropileno de 5 mL redondo tubo inferior para formar a camada superior, mais diluída, do gradiente.Nota: camadas subsequentes de diluições de gradientes mais concentradas serão adicionadas abaixo desta camada usando uma agulha, para não perturbar as camadas. Um mínimo de dois e máximo de três camadas de gradientes de 1ml cada são recomendados para separação robusta e fácil visualização de bactérias. Usando uma seringa descartável 1 mL com agulha de 1,5 polegadas, tome a próximo mais concentrado densidade gradiente médio diluição para a seringa de 1 mL. Evite tomar qualquer ar, como bolhas podem prejudicar as camadas de gradientes. Coloque a extremidade da agulha na parte inferior do tubo que contém a primeira camada. Aspire o conteúdo da seringa lentamente para evitar misturar a interface.Nota: A interface de duas diluições se levantará como a diluição mais concentrada de gradiente é adicionada. Observe a interface, segurando-o até a luz ou uma janela exterior. Não se for observada nenhuma interface distinta, descartar o gradiente e inicie novamente. Remova a agulha gradiente muito suavemente para não perturbar a interface entre as diferentes diluições de gradientes. Coloca o tubo em um rack adequado para mantê-lo ereto. Se usando três diferentes diluições, repita etapas 4.1.1–4.1.2.1, assim a diluição mais densa na parte inferior. Se a gradiente tiver sido construído com sucesso, haverá três camadas distintas com nenhuma mistura com as interfaces. 5. adicionando células preparadas para gradientes e separação por centrifugação Adicione 600 µ l de células preparadas da etapa 3.3 na parte superior do gradiente no tubo muito lentamente e sem misturar a interface, conforme descrito no passo 2.2. Coloque os tubos em adaptadores de tubo e pesar o combinado adaptadores e tubos para garantir que eles são equilibrados. Coloque os adaptadores de tubo em um rotor de ângulo fixo dentro de uma centrífuga de bancada. Centrífuga para 30 min a 3.000 x g. Após a centrifugação, Retire cuidadosamente os tubos, colocá-los em um rack adequado e fotografar os resultados como um registro. Recuperar as frações bacterianas para quantificação de Ácido urónico ou extração de DNA, seguindo passo 6. Se aplicações a jusante não são necessárias, elimine as amostras/gradientes através a rota resíduos biológica líquida apropriada no laboratório.Nota: É importante validar a separação para novas espécies/cepas de bactérias. Frações individuais de gradiente devem ser examinadas por microscopia, por ensaio de Ácido urónico (etapa 8), ou outro ensaio quantitativo adequado para confirmar o fenótipo da cápsula de cada fração. Se o objectivo é separar com base na agregação ou tamanho da célula, independentes ensaios apropriados devem ser usados. 6. recuperação de frações de amostra e consequência opcional passo Recupere as frações de um gradiente, removendo e descartando qualquer tipo de líquido de diluição superior se não bacteriana fração está presente dentro dessa camada. Para remover a fração superior, usar uma pipeta P200 e delicadamente passe a ponta da pipeta através do gradiente para a fração e levar até a fração. Coloque a fração em um tubo de 1,5 mL e rotular apropriadamente. Para recuperar mais fracções, ainda usando a pipeta P200, inserir a ponta suavemente através do gradiente para a fração e recuperar a fração de um tubo 1,5 mL. Remova o excesso gradiente como as frações mais baixo gradiente são acessadas. Se extração de DNA de uma fração que contêm números de célula muito baixo é necessária (por exemplo, para densidade-TraDISort), subcultura a fração, seguindo o protocolo da etapa 6.2 por consequência opcional obter mais células.Nota: Vai haver um baixo nível de reporte de células na parte superior do gradiente em frações inferiores, como frações são removidas de cima para baixo. Minimizar esta trabalhando com cuidado para não misturar o gradiente, usando uma agulha para remover frações inferiores e através da realização de re-purificação de amostras muito baixa abundância onde reportes podem afetar os resultados. Células de transferência da baixo-abundância fracção recuperado em etapas 6.1.1–6.1.2 em 5 mL de meio líquido adequado. Coloque em uma incubadora e crescer durante 2 h a 37 ° C. Depois de 2h de crescimento ou em que a amostra atingiu uma OD600 de 1, transferi a cultura para um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo por 10 min a 3.200 x g em uma centrífuga com swing baldes e tampas apertadas de aerossol. Descartar o sobrenadante Ressuspender as células em 1 mL de 1X PBS. Prepare um gradiente novo single-concentração de densidade em um tubo de polipropileno de 5 mL. Use a gradiente concentração de logo acima a localização da fração no gradiente original (por exemplo, para a purificação do mutanteslyA Δ mostrado na Figura 2D, 15% médio gradiente de densidade seria usado).Nota: esta etapa de re-purificação é opcional. Aplicam-se as células à parte superior do gradiente e centrífuga, conforme descrito nas etapas 2.2 e 5.1. Retirar os tubos de centrífuga e coloc em uma cremalheira apropriada. Fotografar o gradiente e recuperar a fração para extração de DNA, conforme descrito em 6.1 – 6.1.2.Nota: A amostra está agora pronta para extração de DNA ou outras aplicações a jusante. 7. alternativo método para preparação de gradiente de fundo (concentrado) para cima (menos concentrada) usando uma pipeta Use as diluições gradientes determinadas na etapa 2.2.3. Usando uma pipeta de 1.000 µ l, adicione 1 mL da diluição gradiente mais densa para um tubo de 5 mL. Utilizando uma pipeta de 200 µ l, adicione 200 µ l da diluição gradiente densa próxima muito lentamente para o topo da camada no tubo, para não misturar a interface. Adicione outro 200 µ l e depois o final 600 µ l. adicionando vários volumes menores dá mais controle sobre a velocidade de pipetagem e impede a mistura da interface. Se a interface mistura, descartar e começar de novo. Repita a etapa 7.1.1 com a terceira, menos densa concentração de gradiente se três diluições estão sendo usadas. Agora, o tubo deve ter gradientes de 2ml ou 3 mL dependendo dos resultados da etapa 2.2.3. Vá para a etapa 5 do protocolo para adicionar células e continuar o experimento. 8. medida da quantidade de cápsulas por Ácido urónico ensaio Ajuste o OD600 de cada fração recuperada para 4.0 por diluição com PBS. Prossiga com a quantificação de ácidos urônicos como anteriormente publicados1.