Separando i batteri di capsula quantità utilizzando un gradiente di densità discontinua

Nota: Assicurarsi che eventuali valutazioni di rischio applicabile ai ceppi batterici sono rispettate quando la coltura e la manipolazione dei campioni. Essere consapevoli del fatto che impostando troppe sfumature in una sola volta può portare a disturbi muscolo-scheletrici dovuto la pressione sulle articolazioni pipettatura lento coinvolti. Piano di lavoro e prendere precauzioni per evitare lesioni. 1. preparazione di ceppi batterici o librerie mutante Striscia fuori i ceppi di essere testati su piastre di agar appropriato. Queste sono le piastre di stock per l’esperimento. Incubare le piastre durante la notte alla temperatura desiderata per ottenere singole colonie. Per questo esperimento, K. pneumoniae (ceppi NTUH-K2044 e ATCC43816) della coltura su agar di brodo (LB) di Luria a 37 ° C e S. pneumoniae (23F wild type e 23F Δcps) su agar-sangue in un vaso di candela umidificata a 37 ° C. Scegliere una singola Colonia da una piastra d’archivio (punto 1.1) di inoculare 10 mL di brodo appropriato, utilizzando un’ansa sterile o stuzzicadenti. Per lo screening di librerie mutante casuale, inoculare il brodo con 10 µ l di stock casuale mutante biblioteca (TraDIS Library). Incubare K. pneumoniae ceppi a basso sale LB media a 37 ° C con agitazione e ceppi di S. pneumoniae nei media di cervello cuore infusione (BHI), in modo statico a 37 ° C. Trasferire la cultura durante la notte un tubo da 15 mL e centrifugare in una centrifuga di banco per 10 min a 3.200 x g in svolgimento fuori secchi con inserti in tubo da 15 mL e coperchi a tenuta aerosol. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 2 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x.Nota: Smaltire surnatante tramite il percorso dei rifiuti biologico liquido adeguato in laboratorio. Lo scopo dei passaggi centrifugazione e risospensione (1.2.2 e 1.2.3) è quello di concentrare i batteri per una visualizzazione semplice sul gradiente. Le colture batteriche possono essere caricate direttamente su sfumatura se si preferisce. Pesantemente capsulati ceppi non possono formare un pellet stretto. In questo caso, rimuovere tanto surnatante possibile senza rimuovere eventuali cellule batteriche, aggiungere 1X PBS ad un volume finale di 5 mL e risospendere il pellet. Continuare il protocollo con passo 1.2.5. Per i ceppi non-mucoide, andare al passaggio 2. Centrifugare le provette come descritto al punto 1.2.2. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 2 mL di PBS 1X. Le cellule sono ora pronte per l’uso.Nota: La densità della sospensione delle cellule batteriche non è critica, ma deve essere sufficiente per la visualizzazione della sfumatura. Un minimo di OD600 (densità ottica a 600 nm) di 4 è suggerito. 2. preparazione del gradiente diluizioni e mini-gradiente Test Preparare diluizioni gradiente.Nota: Le concentrazioni esatte di medio gradiente di densità (ad es., Percoll) necessari nei gradienti di densità per ottenere una buona separazione saranno diverso a seconda delle condizioni di sforzo e crescita batteriche utilizzata. Mini-gradiente test vengono eseguiti in primo luogo, per identificare le concentrazioni che verranno darà la migliore separazione. Questi comprendono 500 µ l di una diluizione singola in una provetta da 2 mL. Se i batteri verranno estratta dal gradiente e una subcoltura per applicazioni a valle, questa procedura deve essere eseguita in condizioni asettiche. Medio di gradienti di densità si combinano con 1x PBS per rendere le diluizioni di gradienti di densità. Effettuare diluizioni del 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% e 80% (ad esempio, 2 mL di densità gradiente medio e 8 mL di PBS 1x = 10 mL di 20% densità gradiente medio). Aliquotare 500 µ l della diluizione gradiente 20% in una provetta da 2 mL per ogni sforzo essere testati (ad es., 4 ceppi = 4 provette contenenti 500 µ l della diluizione gradiente 20%). Ripetere il passaggio 2.1.2 per il resto delle diluizioni gradiente. Applicare i batteri alla sfumatura. Applicare 100 µ l di cellule batteriche preparato nei passaggi 1.2.3 e 1.2.6 alla parte superiore di ciascuna diluizione gradiente nel seguente modo. Prendere 100 µ l di cellule usando una pipetta a 200 µ l e inserire la punta della pipetta sul lato del tubo appena sotto il menisco della mini-sfumatura. Aspirare le cellule batteriche sulla sfumatura estremamente lentamente in modo che formano uno strato sulla parte superiore della sfumatura, senza alcuna miscelazione dell’interfaccia. Ripetere i passaggi 2.2.1.1–2.2.1.2 per tutti i ceppi da testare. Utilizza un rotore ad angolo fisso con un coperchio stretto di aerosol, centrifugare le provette preparate in una microcentrifuga per 10 min a 8.000 x g. Dopo la centrifugazione, trasferire i tubi a un rack per visualizzare la minima diluizione gradiente necessaria per mantenere le cellule appena sopra il livello di sfumatura dopo centrifugazione. Se i risultati non sono chiari, ripetere il test Mini-gradiente con incrementi di diluizioni medie gradienti di densità 5% sopra e sotto le concentrazioni definite nel passaggio 2.1.1 (ad es. diluizioni di 25% e 35%, dovrebbero essere testati se il risultato al 30% è ambiguo).Nota: Vedere la Figura 2A per i risultati tipici ad una diluizione di medio gradiente di densità singola. Utilizzare i risultati dal 2.2.3–2.2.4 alla seguente procedura per determinare le diluizioni gradiente ideale da utilizzare per separare le cellule in gradienti discontinui su larga scala. 3. preparazione delle cellule per l’esperimento principale Preparare colture fresche durante la notte inoculando 10 mL di brodo appropriato, come descritto al punto 1.2. Incubare le colture durante la notte in condizioni appropriate come descritto al punto 1.2.1. Pellet, la cultura durante la notte come descritto al punto 1.2.2. Lavare le cellule come descritto al punto 1.2.3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS 1X. Se il ceppo è mucoide e non facilmente a pellet, risospendere il pellet in fino a 2 mL di PBS o media residua. Le cellule sono ora pronte per l’uso. 4. preparazione dei gradienti di densità discontinua Nota: Un metodo alternativo di preparazione gradiente dal basso (più concentrata) al top (meno concentrata) usando una pipetta è descritto nel passaggio 7. Pipettare 1 mL della diluizione più diluita densità gradiente in un polipropilene da 5 mL tubo rotondo fondo per formare lo strato superiore, più diluito, della sfumatura.Nota: strati successivi di più concentrati diluizioni gradiente verranno aggiunto sotto questo strato utilizzando un ago, per non disturbare gli strati. Un minimo di due e massimo gradiente tre strati di 1 mL ciascuno sono raccomandati per separazione robusta e facile visualizzazione dei batteri. Usando una siringa monouso da 1 mL con un ago da 1,5 pollici, prelevare 1 mL della prossima più concentrato densità gradiente medio diluizione nella siringa. Evitare l’assunzione di qualsiasi aria, come bolle possono interferire con i livelli di pendenza. Posizionare l’estremità dell’ago nella parte inferiore del tubo contenente il primo strato. Aspirare il contenuto della siringa molto lentamente per evitare il mescolamento dell’interfaccia.Nota: L’interfaccia delle due diluizioni aumenterà come la diluizione più concentrata di gradiente è aggiunto. Osservare l’interfaccia tenendolo fino a luce o una finestra esterna. Se non si è osservata alcuna interfaccia distinto, ignorare il gradiente e iniziare nuovamente. Rimuovere l’ago dal gradiente molto delicatamente per non disturbare l’interfaccia tra le diverse diluizioni di gradiente. Porre la provetta in un rack adatto per tenerlo in posizione verticale. Se utilizza tre differenti diluizioni, ripetere passaggi 4.1.1–4.1.2.1 in modo che la diluizione più densa è nella parte inferiore. Se il gradiente è stato costruito con successo, ci saranno tre strati distinti con nessuna miscelazione alle interfacce. 5. aggiunta di preparati di cellule a gradienti e separazione per centrifugazione Aggiungere 600 µ l di cellule preparate dal punto 3.3 all’inizio della sfumatura nel tubo molto lentamente e senza mescolare l’interfaccia, come descritto al punto 2.2. Posizionare i tubi adattatori di tubo e pesare il combinato adattatori e tubi per garantire che sono equilibrati. Inserire gli adattatori del tubo in un rotore ad angolo fisso all’interno di una centrifuga di banco. Centrifuga a 3.000 x gper 30 minuti. Dopo la centrifugazione, con attenzione rimuovere i tubi, metterli in un rack adatto e fotografare i risultati come un record. Recuperare le frazioni batteriche per quantificazione Acidi uronici o estrazione del DNA dal passaggio 6. Se applicazioni a valle non sono necessari, smaltire i campioni/gradienti tramite il percorso dei rifiuti biologico liquido adeguato in laboratorio.Nota: È importante convalidare la separazione per nuove specie/ceppi di batteri. Singole frazioni dal gradiente dovrebbero essere esaminate secondo microscopia, dosaggio acido uronico (passaggio 8), o un altro dosaggio quantitativo adatto per confermare il fenotipo capsula di ogni frazione. Se l’obiettivo è quello di separare basata su aggregazione o dimensioni della cella, indipendente analisi appropriate devono essere utilizzate. 6. recupero frazioni di campione e passaggio opzionale escrescenza Recuperare le frazioni da un gradiente rimuovendo e annullando qualsiasi liquido dalla diluizione superiore se nessuna frazione batterica è presente all’interno del livello. Per rimuovere la frazione superiore, utilizzare una pipetta P200 e delicatamente passare la punta della pipetta attraverso la sfumatura alla frazione e prendere la frazione. Posizionare la frazione in una provetta da 1,5 mL ed etichettare correttamente. Per recuperare ulteriori frazioni, ancora con la pipetta P200, inserire la punta delicatamente attraverso la sfumatura alla frazione e recuperare la frazione ad un tubo fresco 1,5 mL. Rimuovere la sfumatura in eccesso come le frazioni più in basso il gradiente sono accessibili. Se estrazione del DNA da una frazione contenente numeri molto bassi delle cellule è richiesto (ad esempio, per densità-TraDISort), sottocultura la frazione seguendo il protocollo dal punto 6.2 per escrescenza opzionale ottenere più cellule.Nota: Ci sarà un basso livello di riporto dalle cellule nella parte superiore della sfumatura in frazioni inferiori, come le frazioni vengono rimossi dall’alto verso il basso. Ridurre al minimo questo lavorando con attenzione per non mescolare il gradiente, utilizzando un ago per rimuovere le frazioni inferiori ed eseguendo ri-purificazione di campioni molto bassa abbondanza dove riporto può influenzare i risultati. Cellule di trasferimento dalla frazione bassa-abbondanza recuperati in passaggi 6.1.1–6.1.2 in 5 mL di supporto liquido appropriato. Posto in un’incubatrice e crescere per 2 ore a 37 ° C. Dopo 2 h di crescita o quando il campione ha raggiunto un OD600 di 1, è possibile trasferire la cultura in una provetta da 15 mL. Centrifugare la provetta per 10 min a 3.200 x g in una centrifuga con swing fuori secchi e coperchi a tenuta aerosol. Scartare il surnatante Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1X PBS. Preparare una pendenza di densità di singolo-concentrazione fresco in un tubo in polipropilene da 5 mL. Utilizzare il gradiente concentrazione da appena sopra la posizione della frazione della sfumatura originale (ad es., per la purificazione del mutanteslyA Δ illustrato nella Figura 2D, 15% densità gradiente medio sarebbe stato utilizzato).Nota: questo passaggio di purificazione ri è facoltativo. Applicare le celle nella parte superiore della sfumatura e centrifuga come descritto ai punti 2.2 e 5.1. Rimuovere le provette dalla centrifuga e inserire in un rack appropriato. Fotografare il gradiente e recuperare la frazione per estrazione del DNA come descritto in 6.1 – 6.1.2.Nota: Il campione è ora pronto per l’estrazione del DNA o altre applicazioni a valle. 7. metodo alternativo per preparazione gradiente dal basso (più concentrata) al Top (meno concentrata) usando una pipetta Utilizzare le diluizioni gradiente determinate al punto 2.2.3. Utilizzando una pipetta di 1.000 µ l, aggiungere 1 mL della diluizione gradiente più densa in una provetta da 5 mL. Utilizzando una pipetta 200 µ l, aggiungere 200 µ l della diluizione gradiente densa successiva molto lentamente nella parte superiore dello strato del tubo, per non mescolare l’interfaccia. Aggiungere un altro 200 µ l e quindi il finale 600 µ l. aggiunta di più volumi più piccoli dà più controllo sulla velocità di pipettaggio e impedisce la miscelazione dell’interfaccia. Se l’interfaccia si mescola, scartare e ricominciare. Ripetere il passaggio 7.1.1 con la terza, meno densa concentrazione gradiente se vengono utilizzati tre diluizioni. Il tubo dovrebbe ora avere sfumature di 2 mL o 3 mL a seconda dei risultati dal punto 2.2.3. Passare al punto 5 del protocollo per aggiungere celle e continuare l’esperimento. 8. misurazione della capsula quantità di dosaggio acido uronico Regolare il OD600 ogni frazione recuperata a 4.0 mediante diluizione con PBS. Procedere con quantificazione degli acidi uronici come precedentemente pubblicati1.