不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

注:養殖やサンプルを取り扱い、細菌の緊張に適用可能な任意のリスク評価を守ってとを確認します。一度にあまりにも多くのグラデーションを設定するは関与する低速ピペッティングから接合部の圧力のための筋骨格系障害につながることができます注意してください。作業を計画し、損傷を避けるために措置を講じる。 1. 細菌の緊張または変異ライブラリの準備 適切な寒天版でテストする系統を連勝。これらは実験のためのストック プレートです。 シングル コロニーを達成するために必要な温度で一晩版を孵化させなさい。この実験,のため文化k (NTUH K2044 と ATCC43816 株) 37 ° C で加湿キャンドル瓶に血液寒天培地で 37 ° C、および肺炎球菌感染(23F 野生型および 23F Δcps) でルリア スープ (LB) 寒天の 滅菌ループまたはカクテル棒を使用して適切なスープのストック プレート (ステップ 1.1) 10 mL を接種するから単一コロニーを拾います。ランダム変異ライブラリの検診は、ランダムな変異ライブラリー ストック (TraDIS ライブラリ) の 10 μ L でスープを接種します。 揺れ、37 ° C で減塩 LB 媒体のk株と脳心注入 (BHI) メディア、37 ° C で静的に肺炎球菌感染株を孵化させなさい 15 mL の管と 15 mL チューブ挿入とエアロゾル タイトな蓋のバケットをスイング 3,200 x g で 10 分間、ベンチトップ遠心分離の遠心分離機に一晩かけて培養を転送します。 上澄みを廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 mL にペレットを再懸濁します。注:研究室では、適切な液体生物廃棄物ルートの上澄みで処分します。遠心分離の巻き上がり・ ステップ (1.2.2 と 1.2.3) の目的は、グラデーションで簡単に確認できる細菌を集中します。細菌文化は、好ましい場合グラデーションの上に直接読み込むことができます。大きくカプセル系統は可能性がありますタイトなペレットを形成しません。5 mL の最終巻に 1x PBS を追加この場合、任意の細菌細胞を削除せずできるだけ多く清に削除し、ペレットを再懸濁します。1.2.5 の手順とプロトコルを続行します。 非ムコイド株のためには、手順 2 に進みます。 1.2.2 の手順で説明するようにチューブを遠心分離機します。 上澄みを廃棄し、2 mL の 1x PBS でペレットを再懸濁します。電池は、使用する準備が整いました。注:細菌の細胞懸濁液の密度は重要ではありませんが、グラデーションの可視化のために十分にする必要があります。最小外径600 (600 の光学濃度 nm) 4 が示唆されました。 2. グラデーション希釈とミニ グラデーション テストの準備 グラデーションの希釈液を準備します。注:密度勾配の良好な分離を達成するために必要な密度勾配媒体 (例えばパーコール) の正確な濃度は、使用される細菌の歪みと成長の条件によって異なります。ミニ グラデーション テストは最高の分離を与える濃度を識別するために最初に実行されます。これらは 500 μ L の 2 mL チューブに単一希釈を構成します。細菌がグラデーションから抽出し、下流用継された場合、は、無菌条件の下でこれらの手順を実行する必要があります。 1x PBS 密度勾配希釈をすると密度勾配媒体を組み合わせます。20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% の希釈液を作る (例, 2 mL 密度勾配媒体に加えて、8 mL の 1x PBS 20% 密度勾配媒体の 10 mL を =)。 テストする各緊張に 2 mL チューブに 20% 勾配希釈液の分注 500 μ L (例, 4 系統 = 20% 勾配希釈液 500 μ L を含む 4 つの管)。 ステップ 2.1.2 グラデーションの希釈液の残りの部分に対して繰り返します。 細菌をグラデーションに適用されます。 以下の手順に従って各グラデーション希釈の先頭に手順 1.2.3 と 1.2.6 で作製した細菌細胞の 100 μ L を適用します。 200 μ L ピペットを使用してセルの 100 μ L を取るし、ミニのグラデーションのメニスカスの下管の側面にピペット チップを配置します。 彼らは、インターフェイスの任意の混合することがなくグラデーションの上に層を形成するようグラデーションに細菌の細胞を非常にゆっくりと吸引します。 テストするすべての緊張のための手順 2.2.1.1–2.2.1.2 を繰り返します。 エアロゾル タイトな蓋付き固定角ロータを使用して、遠心分離機の 8,000 の x gで 10 分間遠心機で準備されたチューブ。 遠心分離の後次の遠心傾斜層のすぐ上のセルを保持するために必要な最小勾配希釈を視覚化するラックにチューブを転送します。 結果が明白でない場合 5% 密度勾配中希釈上記の刻みミニ グラデーションのテストを繰り返し、2.1.1 のステップで定義された濃度以下 (例, 25%、35% の希釈テスト必要があります 30% で結果があいまいな場合)。注:図 2は1 つの密度勾配の中希釈の典型的な結果を参照してください。 手順 2.2.3–2.2.4 からの結果を使用し、大規模な不連続勾配のセルを区切るために使用するのに理想的なグラデーション希薄。 3. 主な実験用細胞の調製 一晩の新しい文化を準備するには、1.2 の手順で説明されているように適切なスープの 10 mL を接種します。 1.2.1 手順の説明に従って、適切な条件で一晩文化を孵化させなさい。 1.2.2 の手順で説明されているように一晩文化をペレットします。 1.2.3 のステップで説明するようセルを洗浄してください。 上澄みを廃棄し、1 mL の 1x PBS でペレットを再懸濁します。ひずみがさきは、簡単に餌がない場合は、最大 2 mL の PBS か残留にペレットを再懸濁します。電池は、使用する準備が整いました。 4. 不連続密度勾配の準備 注:(少なくとも集中) ピペットを使用してトップへ (ほとんど集中している) 下からグラデーションの準備の代替方法は、ステップ 7 で説明されます。 ピペット 1 mL 最も希薄 5 mL ポリプロピレンに密度勾配希釈の丸い底部チューブ トップ、最も希薄、グラデーションの層を形成します。注:のレイヤーを妨害しないように、針を使用してレイヤー下より濃度の濃いグラデーション希釈のそれに続く層に追加されます。堅牢な分離と菌の簡単な可視化の 2 つの最小値と最大 1 mL の 3 つのグラデーションのレイヤーのお勧めします。 1 mL のシリンジを使用すると、接続されている 1.5 インチ針、次最も濃縮された密度勾配中希釈の注射器に 1 mL を取る。泡はグラデーションのレイヤーを破壊できるよう、空気の服用を避けます。 最初の層を含んでいる管の下部に針の端を置きます。インターフェイスの混合を避けるために非常にゆっくりと注射器の内容を吸引します。注:2 つの希釈のインターフェイスより濃度の濃いグラデーション希釈が追加されると上昇します。光や外のウィンドウまで保持することによって、インターフェイスを観察します。明確なインターフェイスを認められなかった場合、グラデーションを破棄し、再実行します。 異なるグラデーション希釈率間のインタ フェースの邪魔にならないので非常に軽くグラデーションから針を抜きます。それを直立した保つに適したラックにチューブを置きます。 3 つの異なる希釈率を使用して、手順 4.1.1–4.1.2.1 を繰り返して、密集の希釈は下部に。グラデーションが正常に構築されたインターフェイスでミックスなしで 3 つの層があります。 5. グラデーションや遠心分離によって分離する準備されたセルを追加 準備された細胞の 600 μ L から追加ステップ 3.3 管の勾配の上に非常にゆっくりと、インターフェイスを混合せず手順 2.2 で説明しました。 チューブ アダプターにチューブを置き、均衡を保っているように結合アダプターおよびチューブの重量を量る。 ベンチトップ遠心分離機内の固定角ロータにチューブ アダプターを配置します。3,000 x gで 30 分間遠心します。 遠心分離の後に、慎重にチューブを削除、適切なラックに置いて、結果を記録として写真します。 次のステップ 6 でウロン酸定量または DNA の抽出の細菌の分数を回復します。 下流のアプリケーションは必要ない場合、実験室の適切な液体生物廃棄物ルート経由でサンプル/グラデーションの処分します。注:細菌の新しい種・系統の分離を検証することが重要です。グラデーションから個々 の分数は、ウロン酸アッセイ (手順 8)、または各分画のカプセルの表現型を確認する別の適した定量法による顕微鏡観察検討すべき。目的は、別の集計やセル サイズに基づいて、独立した適切な試金が使わなければなりません。 6. サンプル分数と省略可能な副産物のステップを回復します。 分数をグラデーションから削除と細菌の割合がそのレイヤー内に存在しない場合、トップの希釈から任意の液体を破棄によって回復します。 上部の一部を削除するには、P200 ピペットを使用して優しく分数にグラデーションをピペット チップを渡すし、分数を取る。1.5 mL チューブに分数を置き、適切にラベル付けします。 まだ P200 ピペットを使用して、さらに分数を回復するには、ヒント優しく分数にグラデーションを挿入し、新しい 1.5 mL チューブに分数を回復します。グラデーションの下の分数は、余分なグラデーションを削除します。 場合は非常に低いセル番号を含む画分からの DNA の抽出より多くの細胞を取得するオプションの伸長に 6.2 のステップから次のプロトコル (例えば密度-TraDISort)、必要なサブカルチャー分数です。注:分数が下に上から削除されると、上部下の分数にグラデーションの細胞からの持ち越しの低レベルがあります。慎重に作業してこれを最小限に抑える低分数を削除する針を使用して、持ち越しが結果に影響を与える可能性があります非常に低い豊富なサンプルの再精製を行いグラデーションをミックスしないように。 5 mL の適切な液体培に手順 6.1.1–6.1.2 で回復低豊富な分数から転送細胞。インキュベーターに配置し、37 ° C で 2 h の成長 成長またはサンプルが 1 の外径600に達したときの 2 時間後に、15 mL チューブに文化を転送します。バケットとエアロゾル タイトな蓋をスイングと遠心分離機で 3,200 x gで 10 分間のチューブを遠心します。上澄みを廃棄します。 1 mL の 1x PBS で細胞ペレットを再懸濁します。 5 mL ポリプロピレン チューブに新鮮な単一濃度密度勾配を準備します。(例えば 15% 密度勾配媒体使用図 2D に示すように ΔslyAの突然変異体の浄化) 元のグラデーション内の分数の場所のすぐ上からグラデーションの濃度を使用します。注:この再精製の手順は省略できます。 グラデーションと手順 2.2 および 5.1 では遠心分離機の上にセルを適用します。 遠心分離機からチューブを取り外し、適切なラックに置きます。グラデーションを写真および 6.1-6.1.2 に記載の DNA の抽出の一部をリカバリします。注:サンプルは、DNA の抽出や他のダウン ストリーム アプリケーションの準備が整いました。 7. (少なくとも集中) ピペットを使用して先頭に (ほとんど集中している) 下からグラデーションの準備のための方法 2.2.3 ステップで決定したグラデーションの希薄を使用します。1,000 μ L ピペットで、密度勾配希釈の 1 mL を 5 mL チューブに追加します。 200 μ L ピペットを使用すると、次の高密度勾配希釈 200 μ L はインタ フェースを混在させるように、チューブ内のレイヤーの上に非常にゆっくりと追加します。別の 200 μ L と、最終的な 600 μ L を与えるよりピペッティング速度制御し、インターフェイスの混合を防ぐ複数の小さいボリュームを追加するを追加します。インターフェイスをミックス、破棄し、再度開始。 3 つの希釈液を使用している場合は、第三に、最も少なく密グラデーション濃度 7.1.1 手順を繰り返します。チューブには 2 mL またはステップ 2.2.3 から結果に応じて 3 mL のグラデーションができました。 セルを追加する実験を続行してプロトコルの手順 5 に進みます。 8. ウロン酸法によるカプセルの量の測定 PBS で希釈して 4.0 に回復した各画分の外径600を調整します。以前に発行された1としてウロン酸の定量化を続行します。