Bakteriyel nüfus kapsül üretim temel alarak ayırmak için kesintili yoğunluk gradyanlar kullanımını göstermektedir. Bu yöntem kapsül kültürler arası karşılaştırmak, belirli bir kapsül fenotip mutantlarla yalıtmak veya kapsül düzenleyiciler belirlemek için kullanılır. Burada açıklanan en iyi duruma getirme ve tahlil çalıştırılmasını olduğunu.
Kapsül bağışıklık kaçırma ve çeşitli fiziksel streslere karşı direnç arabuluculuk birçok bakteri türü bir anahtar virülans faktördür. Pek çok yöntem ölçmek ve kapsül üretim farklı suşları veya mutantlar arasında karşılaştırmak kullanılabilir olmakla birlikte, bakterileri göre sıralamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem yoktur işte ne kadar kapsülünde üretiyorlar. Kesintili yoğunluk gradient kullanarak bakteri kapsül tutara göre ayırmak için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem kapsül miktarları yarı kantitatif kültürler, değiştirilmiş kapsül üretim mutantlarla izole etmek ve karmaşık örnekleri capsulated bakterilerden arındırmak için arasında karşılaştırmak için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda genlerin kapsül yönetmelikte yer alan tanımlamak için transposon-ekleme sıralama ile birleştiğinde olabilir. Burada, yöntem degrade koşullar yeni bakteriyel türler veya baskı için en iyi duruma getirme ve nasıl oluşturmak ve yoğunluk gradient çalıştırmak da dahil olmak üzere ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
Birçok bakteri türü bakteriyel hücre çeşitli fiziksel vurguluyor ve tanıma ve öldürme koruyan bağışıklık sistemi tarafından bir polisakkarit kapsülü üretmek. Klebsiella pneumoniaeiçinde kapsül üretim enfeksiyon1,2için mutlak bir gerekliliktir. K. pneumoniae kapsül direnç antimikrobiyal peptidler, direnç kompleman aracılı öldürme, fagositoz önlenmesi ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı3bastırılması için aracılık eder. Fazla kapsül üretim artan virülans ve toplum-(yerine nozokomiyal) infeksiyonları4ile ilişkilidir.
Nicel ve nitel testlerden kapsül üretim araştırmak kullanılabilir. Klebsiella türleri için bu bir koloni için dokundu bir kürdan yukarı doğru çekilir ve üretilen dizenin uzunluğu ölçülür, dize testi5ve, yavaş Santrifüjü içerir mucoviscosity tahlil6, içerir süpernatant optik yoğunluk ölçme tarafından takip bir kültür. Bu yöntem basit ve hızlı ancak klasik Klebsiella üzerinde kullanıldığında duyarlılık suşları kapsül overproducing suşları yerine. Başka bir kapsül miktar teknik olarak zordur ve konsantre sülfürik asit1kullanımını gerektirir uronic asit tahlil yöntemidir. Son olarak, kapsül doğrudan mikroskobu (Şekil 1A) tarafından görülür. Bu yöntemlerden yalnızca mikroskobu farklı birleştıirme Birleşik tek bir nüfus içinde gözlemlemek Kullanıcı sağlar ve bu yöntemlerden hiçbiri capsulated ve capsulated bakteri fiziksel ayrılması sağlar.
Yoğunluk tabanlı renk ayrımları degrade Santrifüjü tarafından rutin olarak hücre biyolojisi farklı ökaryotik hücre türleri7arındırmak için kullanılır, ancak nadiren mikrobiyolojik araştırmada kullanılır. Mucoviscosity tahlil Klebsiella için son derece capsulated bakteriler tarafından Santrifüjü cips için daha fazla zaman ayırın ve bu capsulated hücreleri azaltılmış genel yoğunluğu nedeniyle olabilir gerekçeli gözlem temel alır. Burada gösterilen yöntem K. pneumoniae nüfus ayırmak için fiziksel olarak yoğunluk gradient Santrifüjü (Şekil 1) kullanarak kapsül tutarını tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem diğer bakteriyel türler için geçerli olduğunu belirten Streptococcus pneumoniae, başarıyla uygulandı. Doymuş transposon mutant kitaplığa ayrılması yoğunluğu-gradient transposon-ekleme sıralama ile birleştiğinde (yoğunluk-TraDISort) genleri kapsül üretim ve düzenleme8‘ de yer alan tanımlamak için kullanılır. Benzer şekilde, bu yöntem bireysel kolonileri Başbakan rasgele polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile birlikte capsulated K. pneumoniae ayırmak için kullanılan mutantlar. Bu yöntem kapsül üretim farklı popülasyonlar ve koşullar arasında veya karmaşık örnekleri (Şekil 1B) capsulated bakterilerden arındırmak için hızlı karşılaştırmalar için de kullanılabilir. Son olarak, yoğunluğu, hücre boyutunu veya toplama gibi etkiler diğer fenotipleri tahlil için seçeneği vardır.
Bu el yazması yeni bakteriyel türler veya zorlanma yordamı optimize etmek gösterilmiştir ve inşaat ve hiper-capsulated, capsulated ve capsulated bakteri ayırmak için kesintili yoğunluğu geçişin çalışan gösterir.
Kapsül K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, Acinetobacter10ve Neisseria11 türler de dahil olmak üzere birçok bakteri türü bir önemli virülans faktördür. Miktar ve görselleştirme bakteriyel kapsül için çeşitli yöntemler mevcut olmasına rağmen Şu anda işte fiziksel olarak ayrı capsulated ve capsulated olmayan hücreler için yaygın olarak kullanılan bir yöntem yoktur. Bu makalede, farklı akış yukarı veya aşağı akım iletişim kuralları ile birlikte birden çok olası uygulamaları ile bakteri nüfus kapsül tabanlı ayrılması için sağlam bir yöntem göstermiştir.
Bir yüzey kapsül varlığı yoğunluk gradient Santrifüjü (Şekil 2D) ayırma verir bakteri hücre yoğunluğu azaltabilirsiniz. Biz bu yöntemi K. pneumoniae NTUH-K204412 ve ATCC4381613 yanı sıra Streptococcus pneumoniae 23F14 ve onun Δcps mutant15doğrulanmış var. Düşük viskozite ve zehirlenmesi bakteri – prensip olarak, doğru bu ölçütlerine diğer maddeler vardır kaplı kolloidal silika partikülleri askıya alınmasıdır yoğunluğu geçişin ana kurucu olabilir gibi Percoll16 bu yöntemi kullanır Yoğunluk degrade oluşturmak için kullanılan.
Katmanları farklı yoğunluk yoğunluk gradyanlar oluştururken yaklaşmamalı ve karıştırma devam etmiyorsa, ayırma yöntemi temiz sonuçlar vermeyecektir emin olmak için zor olabilir. Biz bir iğne veya bir pipet kullanarak degradeler, dökme için iki alternatif yöntemler dahil — her ikisi de etkili olduğunu ve hangi metodu sadece tercih meselesi. Bir madde (bakteriyel bir süspansiyon veya daha seyreltik bir degrade katman) bir degrade katmanının pipetting dahil tüm adımlar için daha küçük birimler birden çok aliquots pipetting keskin bir arabirimi herhangi bir katmanları karıştırma olmadan elde etmek yardımcı olacaktır.
Bir bu iletişim kuralı diğer bakteriyel türler ile onun ifa garanti edilemez kısıtlamasıdır. Bu nedenle, bu yeni bakteriyel türler veya bir ek, bağımsız kapsül quantification yöntemiyle yoğunluğu tabanlı ayrılık doğrulamak için zorlanma incelerken önemlidir. Her kesir mevcut bakteri mikroskobu ile uygun kapsül lekeleri tarafından görüntülenmesi detaylı protokolleri kullanılabilir17olduğu bir güvenilir yöntemdir. Alternatif olarak, uronic asitler ( Escherichia coli ve K. pneumoniaegibi) içeren kapsül tarafından belirli bir tahlil Şekil 2B1‘ de gösterildiği gibi sayısal. Bu tahlil de bakteri hücreleri yoğunluğuna bağlı olarak mucoviscosity Santrifüjü tabanlı test bir bağımsız doğrulama yöntemi olarak uygun değildir.
Kapsül üretim çok duyarlı kültür koşulları ve büyüme orta, sıcaklık, hatta küçük değişiklikler veya havalandırma bu tahlil sonuçlarını etkileyebilecek bu yöntemin başka bir kısıtlamadır. Bu sorunu en aza indirmek için araştırmacılar tanımlanmış büyüme orta veya toplu işlem tutarlı bir karmaşık orta, diğer tüm büyüme parametreleri aynı deneyler arasında tutmak ve kullanabilirsiniz beklenmeyen sonuçlar yorumlanması etkinleştirmek için uygun denetimi suşları dahil . Bazı bakteri kapsül kırılgan ve kültürler pipetted zaman uzak hücre yamultabilirsiniz. Kapsül kesme önlemek için kültür centrifuged ve degradenin üzerinde yükleme için hazırlık sırasında en fazla iki kez resuspended. Kapsül kültürlerin toplama sırasında kaybı sorunlu kalırsa, bakteriyel kültürlerde yoğunluğu degradeyi doğrudan, bakteriyel süspansiyon eklendi daha büyük bir hacim ile uygulanabilir görselleştirme için gerekirse.
Diğer bakteriyel türler için geçerlidir ve bu ayrılık farklı akış yukarı ve aşağı akım teknolojileri ile birlikte kullanmak için bu yöntemin gelecekte uygulamalardır. Yoğunluğu TraDISort8ek olarak, biz capsulated bakteri yoğunluğu degrade ayrılması mutant capsulated hücre karma kültürler veya karmaşık örnekleri ve için arıtma için değiştirilmiş kapsül ile yalıtım için kullanılan olabilir öneririz birden fazla suşları kapsül üretim hızlı profil oluşturma. Son olarak, bu teknoloji toplama gibi diğer bakteriyel fenotipleri incelemek için kullanılabilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz Jin-Town Wang ve Susannah Salter suşları ve yararlı tartışmalar için Parkhill grubunun üyeleri sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser Wellcome Sanger Enstitüsü (Wellcome grant 206194) ve F.L.S. (grant 106063/A/14/Z) için bir efendim Henry Wellcome doktora sonrası bursu tarafından finanse edildi. M.J.D. hoş geldiniz Sanger Enstitüsü doktora öğrencilik tarafından desteklenir.
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500ml buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
Adapters for 15ml tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
2.6 – 7ml tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
2ml tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
1.5ml tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
5ml polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
1ml disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
P1000 pipette and tips | |||
P200 pipette and tips |