فصل البكتيريا بمقدار كبسولة استخدام تدرج كثافة متقطع
Summary
ونحن تثبت استخدام التدرجات كثافة متقطع لفصل السكان البكتيرية استناداً إلى إنتاج كبسولة. يتم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة كمية كبسولة بين الثقافات، وعزل طفرات مع النمط الظاهري كبسولة محددة، أو لتحديد المنظمين كبسولة. الموصوفة هنا هو الأمثل وتشغيل المقايسة.
Abstract
كبسولة عامل فوعة رئيسية في العديد من الأنواع البكتيرية، والتوسط للتهرب من المناعة ومقاومة الإجهادات الجسدية المختلفة. حين تتوفر العديد من الطرق لقياس ومقارنة إنتاج كبسولة بين سلالات مختلفة أو طفرات، لا يوجد أي أسلوب المستخدمة على نطاق واسع لفرز البكتيريا على أساس أنها تنتج عن كم كبسولة. قمنا بتطوير طريقة لفصل البكتيريا بمقدار كبسولة، استخدام تدرج كثافة متقطع. يتم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مقادير كبسولة شبه كمي بين الثقافات، لعزل طفرات مع تغيير الإنتاج الكبسولة، وتنقية capsulated البكتيريا من عينات معقدة. هذا الأسلوب يمكن أيضا أن يقترن التسلسل ينقول-الإدراج لتحديد الجينات المشتركة في تنظيم كبسولة. ويتجلى الأسلوب هنا، بالتفصيل، بما في ذلك كيفية تحسين شروط التدرج لأنواع بكتيرية جديدة أو السلالة، وكيفية بناء وتشغيل التدرج الكثافة.
Introduction
العديد من الأنواع البكتيرية تنتج كبسولة السكاريد، الذي يحمي الخلية البكتيرية من مختلف الضغوط المادية والاعتراف وقتل قبل النظام المناعي. في الكلبسيله الرئوية، إنتاج كبسولة شرط مطلق للعدوى1،2. كبسولة K. الرئوية يتوسط مقاومة الببتيدات المضادة للميكروبات، والمقاومة لقتل مكملاً بوساطة، ومنع البلعمه، وقمع ل الاستجابة المناعية الفطرية3. فائض إنتاج كبسولة يرتبط بزيادة الفوعة والعدوى المكتسبة في المجتمع (بدلاً من المستشفيات)4.
وتتوفر مجموعة من الاختبارات الكمية والنوعية للتحقيق في إنتاج كبسولة. للأنواع الكلبسيله ، وتشمل هذه السلسلة اختبار5، التي يتم سحبها مسواك تطرق إلى مستعمرة صعودا ويقاس طول السلسلة تنتجها، وموكوفيسكوسيتي الإنزيم6، الذي ينطوي على الطرد المركزي بطيئة من ثقافة متبوعاً بقياس الكثافة البصرية للمادة طافية. هذه الأساليب هي بسيطة وسريعة، ولكن تفتقر إلى الحساسية عند استخدامه في الكلاسيكية الكلبسيله سلالات بدلاً من سلالات إفراز كبسولة. هو أسلوب آخر للقياس الكمي كبسولة مقايسة حمض uronic، الذي يمثل تحديا من الناحية التقنية ويتطلب استخدام حامض الكبريتيك تركيز1. وأخيراً، كبسولة مرئياً مباشرة عن طريق الفحص المجهري (الشكل 1A). من هذه الأساليب، إلا مجهرية تسمح للمستخدم لمراقبة الدول كابسوليشن مختلفة داخل مجموعة واحدة من سكان، وأيا من هذه الأساليب تمكن الفصل المادي للبكتيريا كابسولاتيد وغير كابسولاتيد.
تستخدم بشكل روتيني في بيولوجيا الخلايا لتنقية الخلية حقيقية النواة مختلف أنواع7فواصل مبنية على الكثافة بالطرد المركزي التدرج، ولكن نادراً ما تستخدم في الأبحاث الميكروبيولوجية. التحليل موكوفيسكوسيتي الكلبسيله يستند إلى ملاحظة أن البكتيريا capsulated عاليا يستغرق مزيدا من الوقت بيليه بالطرد المركزي، ونحن مسبب أن هذا قد يكون بسبب انخفاض الكثافة الإجمالية من الخلايا كابسولاتيد. الأسلوب هو موضح هنا وضعت لفصل السكان K. الرئوية فعلياً بمقدار كبسولة، استخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي (الشكل 1). وكان تطبيق هذا الأسلوب بنجاح العقدية الرئوية، مما يشير إلى أنها تنطبق على الأنواع البكتيرية الأخرى. فصل الكثافة–التدرج من مكتبة متحولة ينقول مشبعة مقترنة بالتسلسل ينقول-الإدراج (الكثافة–تراديسورت) وقد استخدمت لتحديد الجينات المشاركة في الإنتاج والتنظيم كبسولة8. وبالمثل، كان استخدام هذا الأسلوب بالاقتران مع عشوائي رئيس الوزراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من مستعمرات فردية لعزل غير كابسولاتيد الرئوية ك. المسوخ. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لمقارنات سريعة لإنتاج كبسولة بين مختلف قطاعات السكان والظروف، أو لتنقية البكتيريا كابسولاتيد من العينات المعقدة (الشكل 1B). وأخيراً، هناك خيار للاعتداء الأخرى تعمل التي تؤثر على كثافة، مثل حجم الخلية أو التجميع.
يوضح كيفية تحسين الإجراءات الخاصة أنواع بكتيرية جديدة أو سلالة هذه المخطوطة ويدل على تشييد وتشغيل التدرج كثافة متقطع لفصل البكتيريا فرط كابسولاتيد وكابسولاتيد وغير كابسولاتيد.
Protocol
Representative Results
Discussion
كبسولة عامل فوعة هامة في العديد من أنواع الجراثيم بما في ذلك الرئوية ك.3، العقدية الرئوية9و راكدة10والأنواع11 نيسريه. على الرغم من أن هناك أساليب مختلفة للقياس الكمي والتصور كبسولات البكتيرية، في الوقت الحاضر هناك أي أسلوب يستخدم على نطاق واسع لفصل الخلايا كابسولاتيد وغير كابسولاتيد جسديا. في هذه المقالة، قد أثبتنا وسيلة قوية للانفصال على أساس كبسولة سكان الجرثومي، مع العديد من التطبيقات المحتملة بالاقتران مع مختلف البروتوكولات المنبع أو المصب.
وجود كبسولة السطحية يمكن أن تقلل من كثافة الخلايا البكتيرية، التي تسمح بفصل بكثافة التدرج الطرد المركزي (الشكل 2د). ونحن قد التحقق من صحة هذا الأسلوب في الرئوية ك. نتوه-K204412 و ATCC4381613 فضلا عن العقدية الرئوية 23F14 وبه Δcps متحولة15. يستخدم هذا الأسلوب بيركول16 كما يمكن أن تكون المكونات الرئيسية للتدرج الكثافة، وهو تعليق جزيئات السليكا الغروية المغلفة له اللزوجة منخفضة ولا سمية تجاه البكتيريا-من حيث المبدأ، مواد أخرى تفي بهذه المعايير يستخدم لإنشاء التدرج الكثافة.
يمكن أن يكون تحديا لضمان أن لا تخلط طبقات مختلفة الكثافة عند بناء كثافة التدرجات، وإذا كان يحدث خلط، طريقة فصل لا تعطي النتائج نظيفة. أدرجنا اثنين من الأساليب البديلة لصب التدرجات، باستخدام إبرة أو ماصة – وكلاهما فعال، والطريقة التي يجب استخدامها هي ببساطة مسألة تفضيل. لجميع الخطوات التي تنطوي على بيبيتينج مادة (أما تعليق بكتيرية، أو طبقة تدرج أكثر مخفف) فوق طبقة متدرجة، بيبيتينج متعددة مختبرين من أحجام أصغر يمكن جعله أسهل لتحقيق واجهة حادة دون أي خلط الطبقات.
حد من هذا البروتوكول أنه لا يمكن ضمان أدائها مع غيرها من الأنواع البكتيرية. ولذلك، من الأهمية بمكان عند دراسة أحد الأنواع البكتيرية الجديدة أو سلالة للتحقق من صحة الفصل القائم على كثافة استخدام أسلوب التقدير الكمي كبسولة إضافية ومستقلة. تصور البكتيريا الموجودة في كل جزء من الفحص المجهري مع البقع كبسولة المناسبة هو أسلوب الموثوق بها التي هي بروتوكولات مفصلة متاحة17. بدلاً من ذلك، يمكن قياسها كمياً الكبسولات المحتوية على الأحماض أورونيك (مثل الإشريكيّة القولونية و الرئوية ك.) قبل مقايسة محددة كما هو مبين في الشكل 2ب1. اختبار موكوفيسكوسيتي المستندة إلى استخدام الطرد المركزي ليست مناسبة كأسلوب للتحقق مستقل، كما يعتمد هذا التحليل أيضا على كثافة الخلايا البكتيرية.
تقييد آخر لهذا الأسلوب هو أن إنتاج كبسولة حساسة جداً لظروف الثقافة، وحتى التغيرات الصغيرة إلى المتوسطة النمو، درجة الحرارة، أو تهوية قد تؤثر على نتائج هذا الفحص. وللحد من هذه المشكلة، الباحثين يمكن استخدام متوسط نمو محددة أو وسيلة معقدة دفعة متسقة وإبقاء كافة المعلمات الأخرى النمو متطابقة بين التجارب وتشمل سلالات المراقبة المناسبة لتمكين تفسير نتائج غير متوقعة . بعض كبسولات البكتيرية هشة ويمكن القص بعيداً عن الخلية عندما يتم بيبيتيد الثقافات. لتجنب إمالة كبسولات، ينبغي فصل الثقافات وحراكه ليس أكثر من مرتين أثناء التحضير للتحميل على التدرج. إذا كان فقدان الكبسولة أثناء تركيز الثقافات ما زالت إشكالية، الثقافات البكتيرية يمكن تطبيقها على تدرج كثافة مباشرة، مع حجم أكبر من تعليق البكتيرية وأضاف إذا لزم الأمر للتصور.
التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب يتم تطبيقها على الأنواع البكتيرية الأخرى، واستخدام هذا الفصل بالاقتران مع مختلف التكنولوجيات المنبع والمصب. بالإضافة إلى8من الكثافة–تراديسورت، فإننا نقترح أن كثافة الفصل التدرج من البكتيريا كابسولاتيد يمكن أن تستخدم لعزل طفرات مع كبسولة محوره، لتنقية الخلايا كابسولاتيد من الثقافات المختلطة أو العينات المعقدة، وعلى التنميط السريع لإنتاج كبسولة في سلالات متعددة. وأخيراً، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة أخرى تعمل البكتيرية مثل التجميع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر وانغ جين-المدينة وسوزانا سولتر لتوريد السلالات، وأعضاء الفريق برخيل لإجراء مناقشات مفيدة. تم تمويل هذا العمل من معهد سانغر ويلكوم (منحة ويلكوم 206194)، والسير هنري ويلكوم زمالة ما بعد الدكتوراه إلى F.L.S. (منحة 106063/A/14/Z). ويدعم “سنهم دكتوراه معهد سانغر ويلكوم” M.J.D..
Materials
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500ml buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
| Adapters for 15ml tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
| Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
| 2.6 – 7ml tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
| Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
| 2ml tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| 1.5ml tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 5ml polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| 1ml disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
| AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
| P1000 pipette and tips | |||
| P200 pipette and tips |
References
- Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67 (11), 6152-6156 (1999).
- Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6 (3), 1-9 (2015).
- Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80 (3), 629-661 (2016).
- Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Virulence. 4 (2), 107-118 (2014).
- Fang, C. -. T., Chuang, Y. -. P., Shun, C. -. T., Chang, S. -. C., Wang, J. -. T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 697-705 (2004).
- Lai, Y. -. C., Peng, H. -. L., Chang, H. -. Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185 (3), 788-800 (2003).
- Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
- Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. . The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. , (2018).
- Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 871-899 (2015).
- Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986 (6), 880-887 (2016).
- Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75 (5), 1-9 (2017).
- Wu, K. -. M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191 (14), 4492-4501 (2009).
- Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2 (5), (2014).
- Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191 (5), 1480-1489 (2009).
- Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11 (3), 1-21 (2015).
- Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), 1-4 (2009).
