Scheiden van bacteriën per Capsule bedrag met behulp van een discontinue dichtheid verloop

Opmerking: Ervoor zorgen dat een toepassing op de bacteriestammen risicobeoordelingen worden nageleefd wanneer kweken en de behandeling van de monsters. Wees ervan bewust dat teveel hellingen in één keer instellen kan leiden tot spier-en skeletaandoeningen als gevolg van de druk op de gewrichten van de langzame pipetteren betrokken. Werk plannen en voorzorgsmaatregelen te nemen om schade te voorkomen. 1. bereiding van de bacteriestammen of Mutant bibliotheken Streak uit de stammen worden getest op juiste agar platen. Dit zijn de voorraad platen voor het experiment. Incubeer de platen ‘s nachts op de gewenste temperatuur te bereiken één kolonies. Voor dit experiment, cultuur K. pneumoniae (NTUH-K2044 en ATCC43816-stammen) op Luria Bouillon (LB) agar bij 37 ° C, en S. pneumoniae (23F wild type en 23F Δcps) op bloed agar in een pot bevochtigde kaars bij 37 ° C. Kies een één kolonie van een voorraad plaat (stap 1.1) om te enten 10 mL passende bouillon met behulp van een steriele lus of cocktail stick. Inoculeer voor screening van willekeurige mutant Bibliotheken, de bouillon met 10 µL van de willekeurige mutant bibliotheek voorraad (TraDIS Library). Incubeer K. pneumoniae stammen in de lage zout LB-media bij 37 ° C met schudden, en S. pneumoniae stammen in hersenen hart infusie (BHI) media, statisch bij 37 ° C. De overnachting cultuur overbrengen in een tube van 15 mL en centrifuge in een bench-top centrifuge voor 10 min bij 3200 x g in gang uit emmers met 15 mL tube inzetstukken en aërosol strakke deksels. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).Opmerking: Beschikken over supernatant via de passende vloeibare biologische afval weg in het laboratorium. Het doel van de stappen van het centrifugeren en resuspensie (1.2.2 en 1.2.3) is te concentreren van de bacteriën voor eenvoudige visualisatie op de helling. Bacteriële culturen kunnen direct op het verloop worden geladen als de voorkeur. Zwaar ingekapselde stammen kunnen niet vormen een strakke pellet. Als dit het geval is, Verwijder zoveel supernatant mogelijk zonder het verwijderen van eventuele bacteriële cellen, 1 x PBS toevoegen aan een eindvolume van 5 mL en resuspendeer de pellet. Het protocol met stap 1.2.5 blijven. Voor niet-slijmachtig stammen, gaat u naar stap 2. Centrifugeer de buizen zoals beschreven in stap 1.2.2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver 1 x PBS. Cellen zijn nu klaar voor gebruik.Opmerking: De dichtheid van de bacteriële celsuspensie is niet kritisch, maar moet volstaan voor visualisatie in het verloop. Een minimale OD600 (optische dichtheid bij 600 nm) van 4 is gesuggereerd. 2. voorbereiding van de kleurovergang verdunningen en mini verloop Test Maak kleurovergang verdunningen.Opmerking: Exacte concentratie van kleurovergang medium dichtheid (bvPercoll) die in de dichtheid verlopen nodig zijn om goede scheiding zal verschillen naar gelang van de bacteriële stam en groei omstandigheden gebruikt. Mini verloop tests worden eerst uitgevoerd ter identificatie van de concentraties die de beste scheiding zal geven. Deze omvatten 500 µL van een enkelvoudige verdunning in een tube van 2 mL. Als bacteriën worden geëxtraheerd uit het verloop en voor downstream toepassingen overgeënt, moeten deze stappen worden uitgevoerd onder aseptische condities. Kleurovergang medium dichtheid combineren met 1 x PBS te maken van de dichtheid kleurovergang verdunningen. Verdunningen van 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% en 80% maken (bijvoorbeeld, 2 mL dichtheid kleurovergang medium plus 8 mL 1 x PBS = 10 mL 20% dichtheid kleurovergang voedingsbodem). Aliquot 500 µL van de kleurovergang verdunning van 20% in een tube 2 mL voor elke stam te beproeven (b.v., 4 stammen = 4 buizen met 500 µL van 20% kleurovergang verdunning). Herhaal stap 2.1.2 voor de rest van de kleurovergang verdunningen. Toepassing bacteriën op het verloop. Breng 100 µL van bacteriecellen bereid in stappen 1.2.3 en 1.2.6 naar de top van elke kleurovergang verdunning de onderstaande stappen. Neem tot 100 µL van cellen met behulp van een precisiepipet µL 200 en plaats het uiteinde van de pipet aan de kant van de buis net onder de meniscus van het mini verloop. De bacteriecellen op het verloop zeer langzaam worden gecombineerd zodat ze een laag op de bovenkant van de helling, vormen zonder enige mengen van de interface. Herhaal de stappen 2.2.1.1–2.2.1.2 voor alle stammen te beproeven. Met behulp van een vaste hoek rotor met een aërosol strakke deksel, de bereid buizen in een microcentrifuge voor 10 min bij 8.000 x gcentrifugeren. Na het centrifugeren, door de buizen te overbrengen in een rack te visualiseren de minimale helling verdunning moet behouden cellen net boven de gradiënt laag na centrifugeren. Als de resultaten niet duidelijk zijn, herhaal de test van de mini verloop met stappen van 5% dichtheid kleurovergang middellange verdunningen hierboven en hieronder de concentraties gedefinieerd stap 2.1.1 (b.v., 25% en 35% verdunningen moeten worden getest als het resultaat van 30% niet eenduidig is).Opmerking: Zie Figuur 2voor typische resultaten bij een enkele dichtheid kleurovergang middellange verdunning . Gebruik de resultaten van de stappen 2.2.3–2.2.4 om te bepalen van de ideale kleurovergang verdunningen te gebruiken om te scheiden van de cellen in grotere discontinue verlopen. 3. voorbereiding van de cellen voor de belangrijkste Experiment Bereiden van verse overnachting culturen door het enten van 10 mL van de passende Bouillon, zoals beschreven in stap 1,2. Incubeer de culturen ‘s nachts onder geschikte omstandigheden zoals beschreven in stap 1.2.1. Pellet de overnachting cultuur zoals beschreven in stap 1.2.2. Wassen de cellen zoals beschreven in stap 1.2.3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL 1 x PBS. Als de spanning slijmachtig is en doet niet gemakkelijk pellet, resuspendeer de pellet in maximaal 2 mL PBS of residuele media. Cellen zijn nu klaar voor gebruik. 4. voorbereiding van de discontinue dichtheid verlopen Opmerking: Een alternatieve methode voor de bereiding van de gradiënt vanaf onderkant (meest geconcentreerd) naar boven (minste geconcentreerd) met behulp van een precisiepipet wordt beschreven in stap 7. Pipet 1 mL van de meest verdunde kleurovergang verdunning van de dichtheid in een 5 mL-polypropyleen ronde onderkant buis te vormen van de hoogste, meest verdunde, laag van het verloop.Opmerking: opeenvolgende lagen van geconcentreerder kleurovergang verdunningen worden toegevoegd onder deze laag met behulp van een naald, dus niet te verstoren de lagen. Minimaal twee en maximaal drie kleurovergang lagen van elk 1 mL worden aanbevolen voor robuuste scheiding en eenvoudige visualisatie van bacteriën. Met een 1 mL wegwerp injectiespuit met een naald van 1,5 inch aangesloten, neem 1 mL van de volgende meest geconcentreerde dichtheid kleurovergang middellange verdunning in de spuit. Vermijd innemen lucht, zoals bubbels de kleurovergang lagen kunnen verstoren. Plaats het einde van de nld aan de onderkant van de buis met de eerste laag. De inhoud van de injectiespuit zeer langzaam gecombineerd om te voorkomen dat het mengen van de interface.Opmerking: De interface van de twee verdunningen zal stijgen als de geconcentreerder kleurovergang verdunning wordt toegevoegd. Observeer de interface positie houden tot licht of een buiten-venster. Indien geen duidelijke interface wordt waargenomen, het negeren van het verloop en start opnieuw. Verwijder de naald uit het verloop zeer voorzichtig om niet te storen van de interface tussen de verschillende kleurovergang verdunningen. Plaats de buis in een geschikt rek te rechtop houden. Als met behulp van drie verschillende verdunningen, herhaalt u stappen 4.1.1–4.1.2.1 zodat de dichtste verdunning onderaan is. Als het verloop is opgebouwd, zullen er drie verschillende lagen met geen mengen op de interfaces. 5. toevoegen bereid cellen te verlopen en scheiding door centrifugeren Voeg 600 µL van bereid cellen uit stap 3.3 naar de top van het verloop in de buis erg traag en zonder het mengen van de interface, zoals beschreven in stap 2.2. Plaatsen van de buizen in de buis adapters en weegt de gecombineerde adapters en buizen om ervoor te zorgen dat zij evenwichtig zijn. Plaats de buis adapters in de rotor van een vaste hoek binnen een bank-top centrifuge. Centrifugeer gedurende 30 minuten op 3000 x g. Na het centrifugeren, zorgvuldig verwijderen van de buizen, plaats ze in een geschikt rek, en fotograferen van de resultaten als een record. Herstellen van de bacteriële breuken voor uronic zuur kwantificering of DNA-extractie door het volgen van stap 6. Als downstream toepassingen niet vereist zijn, beschikken over de monsters/verlopen via de passende vloeibare biologische afval weg in het laboratorium.Opmerking: Het is belangrijk voor het valideren van de scheiding voor nieuwe soorten/stammen van bacteriën. Individuele breuken uit het verloop moeten worden onderzocht door microscopie, door uronic acid test (stap 8), of een andere geschikte kwantitatieve test om te bevestigen de capsule fenotype van elke fractie. Als het doel is om te scheiden op basis van aggregatie of celgrootte, moeten onafhankelijke passende tests worden gebruikt. 6. herstellen monster breuken en optionele uitgroei stap Herstellen de breuken uit een verloop verwijderen en teruggooi van elke vloeistof uit de hoogste verdunning als geen bacteriële Fractie ontbreekt niet in die laag. Als wilt verwijderen van het bovenste gedeelte, gebruiken een P200 pipet zachtjes passeren de pipet tip via het verloop op de breuk en oppakken van de breuk. Plaats van de breuk in een tube van 1,5 mL en label op de juiste manier. Om te herstellen van verdere fracties, nog steeds met behulp van de P200 Pipet, invoegen de tip zachtjes door het verloop op de breuk en de breuk tot een verse 1,5 mL koker te herstellen. Verwijder overtollige verloop zoals de breuken lager in het verloop worden benaderd. Als DNA-extractie uit een breuk met zeer lage cel nummers vereist (bv. voor dichtheid-TraDISort), subcultuur de Fractie is door het protocol te volgen vanaf stap 6.2 voor optionele uitgroei te verkrijgen meer cellen.Opmerking: Er zullen een laag niveau van overdracht van cellen aan de bovenkant van het verloop in lagere breuken, zoals breuken zijn verwijderd van boven naar beneden. Dit te minimaliseren door het zorgvuldig werken om niet het verloop, Meng door met een naald te verwijderen van lagere breuken, en door het uitvoeren van re-zuivering van zeer lage overvloed monsters waar de overdracht van invloed kan zijn op de resultaten. De cellen van de overdracht van de Fractie van de lage-overvloed teruggevonden in stappen 6.1.1–6.1.2 in 5 mL van de passende vloeibare media. Plaats in een incubator en groeien gedurende 2 uur bij 37 ° C. Na 2 uur van groei of wanneer het monster een OD600 1 heeft bereikt, door de cultuur te overbrengen in een tube van 15 mL. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 3200 x g in een centrifuge met schommel emmers en aërosol strakke deksels. Verwijder het supernatant Resuspendeer de cel pellet in 1 mL 1 x PBS. Voorbereiding van een verse single-concentratie dichtheid verloop in een polypropyleen tube van 5 mL. Gebruik de kleurovergang concentratie van net boven de locatie van de breuk in het oorspronkelijke verloop (bv. voor zuivering van de ΔslyA mutant afgebeeld in Figuur 2D, 15% dichtheid kleurovergang medium zou worden gebruikt).Opmerking: deze re-zuivering stap is optioneel. De cellen toepassen op de bovenkant van de kleurovergang en centrifuge zoals beschreven in stappen 2.2 en 5.1. Verwijder de buizen van de centrifuge en plaats in een passende rek. Foto van het verloop en de breuk voor DNA-extractie zoals beschreven in 6.1 – 6.1.2 te herstellen.Opmerking: Het monster is nu klaar voor DNA-extractie of andere downstream toepassingen. 7. alternatieve methode voor de voorbereiding van de gradiënt vanaf onderkant (meest geconcentreerd) naar boven (minste geconcentreerd) met behulp van een precisiepipet Gebruik de kleurovergang verdunningen in stap 2.2.3 vastgesteld. Met behulp van een precisiepipet µL 1.000, 1 mL van de dichtste kleurovergang verdunning aan een tube van 5 mL toevoegen. Met behulp van een pipet 200 µL, voeg 200 µL van de volgende dichte kleurovergang verdunning zeer langzaam naar de top van de laag in de buis, dus niet te mengen van de interface. Voeg een andere 200 µL en vervolgens de laatste 600 µL. meerdere kleinere volumes geeft meer controle over pipetting snelheid en voorkomt vermenging van de interface toe te voegen. Als de interface mixen, verwijderen en opnieuw te beginnen. Herhaal stap 7.1.1 met de derde, minste dichte concentratie van kleurovergang als drie verdunningen worden gebruikt. Nu moeten de buis gradiënten van 2 mL of 3 mL afhankelijk van de resultaten van stap 2.2.3. Ga naar stap 5 van het protocol aan cellen toevoegen en voortzetten van het experiment. 8. meting van de Capsule bedrag door Uronic Acid Test De OD-600 van elke herstelde breuk naar 4.0 aanpassen door verdunning met PBS. Ga verder met de kwantificering van uronic zuren als eerder gepubliceerde1.