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Genetics

Trennung von Bakterien durch Kapsel Betrag mittels einer diskontinuierlichen Dichtegradienten

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58679
, , , ,
1Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, 2Department of Medicine,University of Cambridge

Summary

Wir zeigen die Verwendung von diskontinuierlichen Dichtegradienten Bakterienpopulationen basierend auf Kapselproduktion zu trennen. Diese Methode wird verwendet, zu vergleichen Kapsel Betrag zwischen Kulturen, durch Mutation entstehende Variationen mit einer speziellen Kapsel Phänotyp zu isolieren oder Kapsel Regulierungsbehörden zu identifizieren. Hier beschrieben ist die Optimierung und Durchführung des Tests.

Abstract

Kapsel ist eine wichtige Virulenzfaktor in vielen Bakterienarten, Vermittlung von immun ausweichen und Resistenz gegenüber verschiedenen körperlichen Belastungen. Während viele Methoden zur Verfügung, zu quantifizieren und Kapselproduktion zwischen verschiedenen Stämmen oder Mutanten zu vergleichen, gibt es keine weit verbreitete Methode zum Sortieren von Bakterien basiert auf wieviel Kapsel, die sie produzieren. Wir entwickelten eine Methode, um die Bakterien durch die Kapsel Menge trennen mit einer diskontinuierlichen Dichtegradienten. Diese Methode dient zum Vergleich Kapsel Mengen semi-quantitativ zwischen Kulturen, Mutanten mit veränderten Kapselproduktion isolieren und verkapselte Bakterien aus komplexen Proben zu reinigen. Diese Methode kann auch mit Transposon-Einfügung Sequenzierung Kapsel Verordnung beteiligten Gene identifizieren gekoppelt werden. Hier wird die Methode im Detail, darunter, wie die Gradientenbedingungen für eine neue Bakterienspezies oder Belastung zu optimieren und zum Erstellen und Ausführen der Dichtegradient nachgewiesen.

Introduction

Viele Bakterienarten produzieren eine Polysaccharid-Kapsel, die die Bakterienzelle aus verschiedenen körperlichen Belastungen und Anerkennung und Tötung des Immunsystems schützt. Kapselproduktion ist Klebsiella Pneumoniaeein absolutes muss für Infektion1,2. K. Pneumoniae Kapsel vermittelt Resistenz gegen antimikrobielle Peptide, Widerstand gegen die Ergänzung-vermittelten Tötung, Prävention von Phagozytose und Unterdrückung der angeborenen Immunantwort3. Kapsel Überproduktion ist mit erhöhter Virulenz und (anstelle von nosokomialen) ambulant erworbenen Infektionen4verbunden.

Eine Reihe von quantitativen und qualitativen Tests stehen Kapselproduktion untersuchen. Für Klebsiella -Arten dazu gehören die Zeichenfolge Test5, in dem ein Zahnstocher berührt eine Kolonie nach oben gezogen und die Länge der Zeichenfolge produziert gemessen, und die Mucoviscosity Assay6beinhaltet die langsame Zentrifugation von eine Kultur, die durch die Messung der optischen Dichte des Überstands gefolgt. Diese Methoden sind einfach und schnell, aber mangelnde Sensibilität auf klassischen Klebsiella verwendet strapaziert statt Kapsel überproduzierender Stämme. Eine andere Methode der Kapsel Quantifizierung ist die Uronic Säure Assay, die ist technisch anspruchsvoll und erfordert die Verwendung von konzentrierter Schwefelsäure1. Schließlich ist die Kapsel sichtbar direkt durch Mikroskopie (Abbildung 1A). Von diesen Methoden nur Mikroskopie ermöglicht es dem Benutzer, verschiedene selung Staaten innerhalb einer einzigen Population zu beobachten, und keine dieser Methoden ermöglicht die räumliche Trennung von verkapselten und nicht verkapselte Bakterien.

Dichte-basierten Separationen durch gradient Zentrifugation werden routinemäßig in der Zellbiologie verwendet, um andere eukaryotische Zelle Arten7zu reinigen, aber werden selten in der mikrobiologischen Forschung verwendet. Mucoviscosity-Assay für Klebsiella basiert auf der Beobachtung stark verkapselte Bakterien nehmen mehr Zeit, um durch Zentrifugation pellet, sodass wir gefolgert, daß dies möglicherweise aufgrund reduzierter Gesamtdichte der verkapselten Zellen. Die hier gezeigte Methode wurde entwickelt, um K. Pneumoniae Populationen trennen physisch durch Kapsel Menge, mit Dichte Gradienten Zentrifugation (Abbildung 1). Diese Methode wurde erfolgreich angewendet, Streptococcus Pneumoniae, darauf hinweist, dass sie auf andere Bakterienarten anwendbar ist. Dichtegradient Trennung einer gesättigten Transposon mutierten Bibliothek gepaart mit Transposon-Einfügung Sequenzierung (Dichte-TraDISort) wurde verwendet, um Gene, die in der Kapsel Produktion und Verordnung8zu identifizieren. In ähnlicher Weise wurde diese Methode in Verbindung mit random-Prime Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der einzelnen Kolonien verwendet, um nicht verkapselte K. Pneumoniae zu isolieren Mutanten. Diese Methode kann auch verwendet werden, für schnelle Vergleiche von Kapselproduktion zwischen verschiedenen Populationen und Bedingungen oder verkapselte Bakterien aus komplexen Proben (Abbildung 1 b) zu reinigen. Schließlich gibt es die Möglichkeit, anderen Phänotypen assay, die Dichte, wie z. B. Zellengröße oder Aggregation zu beeinflussen.

Dieses Manuskript wird veranschaulicht, wie das Verfahren für eine neue Bakterienspezies oder Belastung zu optimieren und zeigt den Bau und Betrieb einer diskontinuierlichen Dichtegradienten hyper-verkapselte, verkapselte und nicht verkapselte Bakterien zu trennen.

Protocol

Hinweis: Sicherstellen Sie, dass alle Bakterienstämme für Risikobewertungen bei der Kultivierung und Umgang mit Proben eingehalten werden. Seien Sie sich bewusst, dass zu viele Steigungen auf einmal einrichten zu Muskel-Skelett-Erkrankungen durch den Druck auf Gelenke von der langsamen Pipettieren Beteiligten führen kann. Planen Sie Arbeit und Vorkehrungen Sie treffen, um Verletzungen zu vermeiden. 1. Vorbereitung der Bakterienstämme oder mutierten Bibliotheken Streifen, die Stämme auf entsprechenden Agarplatten getestet werden. Das sind Lager Platten für das Experiment. Inkubieren Sie die Platten über Nacht auf der gewünschten Temperatur, einzelne Kolonien zu erreichen. Kultur für dieses Experiment, K. Pneumoniae (NTUH-K2044 und ATCC43816 Stämme) auf Luria Brühe (LB) Agar bei 37 ° C und S. Pneumoniae (23F Wildtyp und 23F Δcps) auf Blutagar in einem befeuchteten Kerze Glas bei 37 ° C. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einem Lager Teller (Schritt 1.1) 10 mL impfen entsprechende Brühe mit einem sterilen Schleife oder Cocktailspieß. Impfen Sie für das Screening von zufälligen mutierten Bibliotheken die Brühe mit 10 µL zufällige Mutante Bibliotheksbestand (TraDIS Bibliothek). Inkubieren Sie K. Pneumoniae -Stämme in niedrigen Salz LB Medien bei 37 ° C mit schütteln und S. Pneumoniae -Stämme im Gehirn Herz Infusion (BHI) Medien, statisch bei 37 ° c Übertragen Sie Nacht Kultur eine 15 mL Tube und Zentrifuge in einer Benchtop-Zentrifuge für 10 min bei 3.200 x g im Eimer mit 15 mL Tube Einsätzen und Aerosol engen Deckel ausschwenken. Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 2 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).Hinweis: Entsorgen Sie überstand über die entsprechende flüssige biologische Abfälle Route im Labor. Die Zentrifugation und Wiederfreisetzung Schritte (1.2.2 und 1.2.3) soll die Bakterien für einfache Visualisierung auf der Steigung zu konzentrieren. Bakterienkulturen können direkt auf den Farbverlauf geladen werden, falls gewünscht. Stark verkapselte Stämme können keinen enge Pellet bilden. In diesem Fall so viel überstand wie möglich entfernen, ohne irgendwelche Bakterienzellen hinzu einem Endvolumen von 5 mL 1 X PBS und Aufschwemmen der Pellets. Das Protokoll mit Schritt 1.2.5 weiter. Gehen Sie für nicht-Mucoid Stämme zu Schritt 2. Zentrifugieren Sie die Rohre, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 2 mL 1 X PBS Aufschwemmen. Zellen sind nun einsatzbereit.Hinweis: Die Dichte der Bakterienzelle Suspension ist nicht kritisch aber zur Visualisierung im Verlauf ausreichen müsste. Eine minimale OD600 (Extinktion bei 600 nm) von 4 vorgeschlagen. 2. Vorbereitung des Gradienten Verdünnungen und Mini-Verlaufs-Test Gradient Verdünnungen vorzubereiten.Hinweis: Genaue Konzentrationen von Dichte Gradienten Medium (z. B.Percoll) in die Dichtegradienten benötigt, um gute Trennung erreichen variieren je nach der bakteriellen Belastung und Wachstum Bedingungen verwendet. Erstens werden Mini-Gradienten Tests durchgeführt, um die Konzentrationen zu identifizieren, die die besten Trennung geben wird. Dabei handelt es sich um 500 µL einer einzigen Verdünnung in eine 2 mL-Tube. Wenn Bakterien aus den Farbverlauf extrahiert und für downstream-Anwendungen subkultiviert, sollten diese Schritte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Dichte-Gradienten-Medium mit 1 X PBS die Dichte-Gradienten-Verdünnungen zu kombinieren. Verdünnungen von 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % und 80 % zu machen (z.B., 2 mL Dichte Gradienten Medium plus 8 mL 1 X PBS = 10 mL 20 % Dichte Gradienten Medium). Aliquoten 500 µL der 20 % Steigung Verdünnung in eine 2 mL-Tube für jede Belastung getestet werden (z.B., 4 Stämme = 4 Röhrchen mit 500 µL 20 % Steigung Verdünnung). Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 für den Rest der Gradienten Verdünnungen. Bakterien auf den Farbverlauf anwenden. Gelten Sie 100 µL der Bakterienzellen vorbereitet in den Schritten 1.2.3 und 1.2.6 an die Spitze der jeder Farbverlauf Verdünnung, die folgenden Schritte. 100 µL der Zellen mit einer 200 µL Pipette nehmen Sie und setzen Sie die Pipettenspitze auf der Seite der Röhre direkt unter den Meniskus des Mini-Verlaufs. Aspirieren Sie die Bakterienzellen auf den Farbverlauf sehr langsam damit sie eine Schicht auf der Oberseite der Farbverlauf bilden ohne jede Vermischung der Schnittstelle. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1.1–2.2.1.2 für alle Sorten getestet werden. Mit einem festen Winkel-Rotor mit einem Aerosol dichten Deckel, die vorbereitete Rohre in einem Microcentrifuge für 10 min bei 8.000 X gzentrifugieren. Übertragen Sie nach Zentrifugation die Röhren auf eine Halterung, um die minimale Steigung Verdünnung Zellen oberhalb der Verlaufsebene nach Zentrifugation Aufbewahrung verpflichtet zu visualisieren. Wenn die Ergebnisse nicht klar sind, wiederholen Sie den Mini-Verlaufs-Test mit Schritten von 5 % Dichte Gradienten mittlere Verdünnungen oben und unten die Konzentrationen in definierten Schritt 2.1.1 (z. B., 25 % und 35 % Verdünnungen sollten getestet werden, wenn das Ergebnis bei 30 % mehrdeutig ist).Hinweis: Siehe Abbildung 2A für typische Ergebnisse bei einer Einzel-Dichte Gradienten mittlere Verdünnung. Verwenden Sie die Ergebnisse aus Schritte 2.2.3–2.2.4, um festzustellen, die ideale Gradienten Verdünnungen verwenden, um Zellen im größeren Maßstab diskontinuierliche Verläufe zu trennen. 3. Vorbereitung der Zellen für das wichtigste Experiment Bereiten Sie frische Übernachtung Kulturen durch impfen 10 mL des entsprechenden Brühe, wie unter Punkt 1.2 beschrieben. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht in geeigneter Weise, wie unter Punkt 1.2.1 beschrieben. Pellet-Übernachtung Kultur wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Waschen Sie die Zellen, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 mL 1 X PBS Aufschwemmen. Wenn der Stamm Mucoid und nicht leicht pellet, Aufschwemmen Sie das Pellet in bis zu 2 mL PBS oder passives Medium. Zellen sind nun einsatzbereit. 4. Vorbereitung der diskontinuierlichen Dichtegradienten Hinweis: Eine alternative Methode der gradient Vorbereitung von unten (am meisten konzentriert) nach oben (mindestens konzentriert) mit einer Pipette wird in Schritt 7 beschrieben. 1 mL der meisten verdünnten Dichte Gradienten Verdünnung in eine 5 mL Polypropylen Pipette runden Unterrohr an der Spitze, die meisten verdünnten Schicht des Farbverlaufs.Hinweis: nachfolgende Schichten von konzentrierter gradient Verdünnungen hinzukommen werden, unterhalb dieser Schicht mit Hilfe einer Nadel, um nicht die Schichten zu stören. Mindestens zwei und maximal drei Farbverlauf Schichten von 1 mL sind für robuste Trennung und einfache Visualisierung von Bakterien empfohlen. Mit Hilfe einer 1 mL-Einwegspritze mit einem 1,5 Zoll Nadel befestigt, 1 mL der nächsten konzentriertesten Dichte Gradienten mittlere Verdünnung in die Spritze zu nehmen. Vermeiden Sie, Luft, wie Luftblasen die Farbverlauf Schichten stören können. Legen Sie das Ende der Nadel am unteren Ende der Röhre mit der ersten Schicht. Aspirieren Sie den Inhalt der Spritze sehr langsam um zu vermeiden, mischen die Schnittstelle.Hinweis: Die Schnittstelle von zwei Verdünnungen werden steigen, da konzentriertere gradient Verdünnung hinzugefügt wird. Hielt es gegen Licht oder ein Fenster, um die Schnittstelle zu beobachten. Wenn keine deutliche Schnittstelle zu beobachten ist, die Steigung zu verwerfen und erneut starten. Entfernen Sie die Nadel aus der Steigung sehr sanft, also nicht auf die Schnittstelle zwischen verschiedenen Gradienten Verdünnungen stören. Platzieren Sie das Rohr in einem geeigneten Rack, es aufrecht zu halten. Wenn drei verschiedene Verdünnungen verwenden, wiederholen Sie Schritte 4.1.1–4.1.2.1, sodass die dichteste Verdünnung an der Unterseite ist. Wenn die Steigung erfolgreich erstellt wurde, werden drei unterschiedliche Schichten mit keine Vermischung an den Schnittstellen. 5. Hinzufügen von vorbereitete Zellen auf Steigungen und Trennung durch Zentrifugation Fügen Sie 600 µL vorbereitete Zellen aus Schritt 3.3 an die Spitze des Verlaufs in der Röhre sehr langsam und ohne Vermischung der Schnittstelle, wie unter Punkt 2.2 beschrieben. Legen Sie die Rohre in Rohr-Adapter und wiegen Sie die kombinierten Adapter und Rohre, um sicherzustellen, dass sie ausgeglichen sind. Legen Sie die Schlauch-Adapter in einem festen Winkel Rotor innerhalb einer Benchtop-Zentrifuge. Zentrifuge für 30 min bei 3.000 X g. Nach Zentrifugation sorgfältig entfernen Sie die Rohre zu, legen Sie sie in einem geeigneten Rack und fotografieren Sie die Ergebnisse als Datensatz zu. Die bakterielle Brüche für Uronic Säure Quantifizierung zu erholen oder DNA-Extraktion, indem Sie die folgenden Schritt 6. Wenn downstream-Anwendungen nicht erforderlich sind, entsorgen der Proben/Steigungen über die entsprechende flüssige biologische Abfälle Route im Labor.Hinweis: Es ist wichtig, die Trennung für neue Arten/Sorten von Bakterien zu validieren. Einzelne Fraktionen aus der Steigung sollte Mikroskopie, von Uronic Acid Test (Schritt 8) oder eine andere geeignete quantitative Assay den Kapsel Phänotyp der einzelnen Fraktionen zu bestätigen untersucht werden. Wenn das Ziel ist es, basierend auf Aggregation oder Zellengröße zu trennen, sollten unabhängige entsprechende Tests verwendet werden. 6. Wiederherstellung Probe Brüche und Optional Auswuchs Schritt Erholen Sie sich die Fraktionen von einen Farbverlauf durch entfernen und keine Flüssigkeit aus der oberen Verdünnung zu verwerfen, wenn keine bakterielle Bruch innerhalb dieser Schicht vorhanden ist. Um den oberen Teil zu entfernen, verwendet P200 Pipette vorsichtig passieren die Pipettenspitze durch die Steigung auf den Bruchteil und nehmen den Bruch. Legen Sie den Bruch in eine 1,5 mL-Tube und entsprechend beschriften. Um weitere Brüche, noch mit der Pipette P200 wiederherstellen setzen Sie die Spitze sanft durch die Steigung auf den Bruchteil und erholen Sie den Bruch zu einem frischen 1,5 mL Schlauch zu. Entfernen Sie überschüssige Farbverlauf wie die Fraktionen weiter unten das Gefälle erreicht werden. Wenn DNA-Extraktion aus einer Fraktion mit sehr niedrigen Zellzahlen erforderlich (z. B. Dichte-TraDISort), Subkultur der Bruch ist, indem Sie das Protokoll aus Schritt 6.2 für optionale Auswuchs, mehr Zellen zu erhalten.Hinweis: Es werden ein niedriges Niveau der Übertrag von Zellen an der Spitze des Farbverlaufs in unteren Fraktionen Bruchteile von oben nach unten entfernt werden. Dies zu minimieren, indem Sie vorsichtig arbeiten um nicht mischen die Steigung mit einer Nadel, um untere Brüche zu entfernen und durch die Durchführung erneute Reinigung des sehr niedrigen Fülle Proben wo Übertrag Ergebnisse beeinflussen kann. Transfer-Zellen aus der Low-Fülle-Fraktion erholte sich in Stufen 6.1.1–6.1.2 in 5 mL des entsprechenden flüssigen Medien. Legen Sie im Brutkasten und wachsen für 2 h bei 37 ° C. Übertragen Sie nach 2 h von Wachstum oder wenn die Probe eine OD600 1 erreicht hat die Kultur auf eine 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei 3.200 X g in einer Zentrifuge mit Swing, Eimern und Aerosol engen Deckel. Den Überstand verwerfen Die Zelle Pellet in 1 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Bereiten Sie eine frische Single-Konzentration Dichtegradient in eine 5 mL-Polypropylen-Rohr. Verwenden Sie die gradient Konzentration aus direkt über die Lage des Bruches im ursprünglichen Verlauf (z. B. Reinigung des ΔSlyA mutierten, dargestellt in Abbildung 2D, 15 % Dichte-Gradienten-Medium verwendet werden würde).Hinweis: dieser erneute Reinigungsschritt ist optional. Wenden Sie die Zellen an die Spitze der Steigung und der Zentrifuge wie in 2.2 und 5.1 beschrieben. Die Röhren aus der Zentrifuge zu entfernen und in einem geeigneten Rack platzieren. Die Neigung zu fotografieren und den Bruch für DNA-Extraktion, wie unter 6.1 – 6.1.2 zu erholen.Hinweis: Die Probe ist nun bereit für die DNA-Extraktion oder anderen downstream-Anwendungen. 7. alternative Verfahren zur Gradient Zubereitung von unten (am meisten konzentriert) nach oben (mindestens konzentriert) mit einer Pipette Verwenden Sie die Farbverlauf Verdünnungen in Schritt 2.2.3 bestimmt. Mit einer 1.000 µL Pipette, 1 mL der dichteste gradient Verdünnung fügen Sie eine 5 mL-Tube hinzu. Mit einer 200 µL Pipette, fügen Sie 200 µL der nächsten Dichte Gradienten Verdünnung sehr langsam an die Spitze der Schicht in der Röhre, um nicht die Schnittstelle zu mischen. Fügen Sie ein weiteres 200 µL und dann die letzten 600 µL. mehrere kleinere Volumina bietet mehr Kontrolle über Pipettieren Geschwindigkeit und verhindert Vermischung der Schnittstelle hinzufügen. Wenn die Schnittstelle mischt, verwerfen und erneut starten. Wiederholen Sie Schritt 7.1.1 mit der dritten, wenigsten dichte Gradienten Konzentration, wenn drei Verdünnungen verwendet werden. Die Röhre müsste nun Steigungen von 2 mL oder 3 mL je nach den Ergebnissen von Schritt 2.2.3. Gehen Sie zu Schritt 5 des Protokolls zum Zellen hinzufügen und weiter das Experiment. 8. Messung Kapsel Menge von Uronic Acid Test Passen Sie die OD600 der einzelnen wiederhergestellten Fraktionen auf 4.0 durch Verdünnung mit PBS. Quantifizierung der Uronic Säuren wie zuvor veröffentlichten1fortsetzen.

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt. Das genaue Ergebnis erwarten richtet sich nach der Bakterienarten, die Einrichtung von Dichtegradienten, und ob der Benutzer einen einzelnen Stamm oder einen Pool von Mutanten untersucht. Die meisten Sorten werden an einem einzigen Speicherort in einem Farbverlauf migriert, wie in Abbildung 2A gezeigt und 2D. Anwendung der Methode zu einer bakteriellen mutierten Bibliothek wird zu einem großen Band über die Steigung, eine geringere Dichte Band verteilt durch die oberste Schicht des Farbverlaufs und eine kleinere Acapsular Bruchteil an der Unterseite (Abbildung 2B) führen. Diese Fraktionen unterscheiden sich in Kapsel Menge dargestellt durch einen Test für Uronic Säuren (Abbildung 2B). Transposon Einfügung Abfolge der einzelnen Fraktionen führt zu klaren Lokalisierung von bestimmten Mutanten in verschiedenen gradient Bruchteilen, wie für die Kapsel Biosynthese Locus von K. Pneumoniae ATCC43816 gezeigt (Abbildung 2C). Repräsentative Ergebnisse für Reinkulturen von K. Pneumoniae NTUH-K2044 und S. Pneumoniae, und verschiedene Kapsel Biosynthese oder regulatorische Mutanten sind in Abbildung 2Ddargestellt. Abbildung 1 : Schaltplan der Dichte Zentrifugation Methode, Bakterien anhand der Kapsel und ihre Anwendungen zu trennen. (A) ein Elektronenmikroskopie-Bild von einem verkapselten Klebsiella Pneumoniae Zelle. Die Kapsel ist als eine dichte Schicht auf der Außenseite der Zelle sichtbar. (B) Anwendungen der Dichte Zentrifugation zur Erforschung von verkapselten Bakterien. (Bi) Dichtetrennung kann zur Erzeugung von hoch-, tief- und keine-Kapsel Bruchteile einer mutierten Transposon-Bibliothek und gefolgt von Transposon Einfügung Sequenzierung Gene zu definieren, die Kapsel Produktion beeinflussen. (Bii) Reinigung von verkapselten Bakterien aus einer komplexen Stichprobe. (Biii) Verwendung von Dichte-basierte Trennung für schnelle Vergleiche der Kapsel Betrag zwischen Proben. Diese Methode ermöglicht auch die Visualisierung von heterogenen Kapselproduktion in Bakterienpopulationen, wie in (Biii) gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse. (A) Beispiel für die Ausgabe von Mini-Gradienten-Tests. Zwei verschiedenen K. Pneumoniae -Stämme wurden auf 1 mL 15 % Dichte Gradienten Medium zentrifugiert. Hypermucoviscous NTUH-K2044 Belastung bleibt über die Dichte mittlere Verlaufsebene, während ATCC43816 (wodurch weniger Kapsel) an der Unterseite der Schicht wandert. (Bi) Nutzung der Dichtegradient eine Transposon mutierten Bibliothek in drei Fraktionen zu trennen. Beachten Sie, dass der untere Teil einen geringen Anteil von Mutanten enthält und auf diesem Bild nicht sichtbar ist. (Bii) Validierung der Kapsel unterschiedlich in der oberen, mittleren und unteren Brüche mit einem Assay für Uronic Säuren. Zellen von den oberen, mittleren und entwachsen unten Fraktionen wurden isoliert und Nukleinsäuretablette mit PBS-Puffer auf eine OD600 4, Kapsel dann Polysaccharide extrahiert und Uronic Säuren gemessen1. (C) Beispiel Dichte-TraDISort Ergebnisse. Mutation Standorte identifiziert werden durch blaue Linien oberhalb des Chromosom-Diagramms dargestellt. Mutanten fehlt Kapsel können als diejenigen identifiziert werden, die in der Eingabe Bibliothek vorhanden, aber in der oberen Fraktion während der unteren Anteil angereichert erschöpft sind, wie hier für die Kapsel Biosynthese Locus8gezeigt. (D) ein Beispiel für die Verwendung von Dichte-Gradienten-Zentrifugierung Kapsel Betrag zwischen Wildtyp und Mutanten Stämme von K. Pneumoniae NTUH-K2044 und S. Pneumoniae 23F zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Kapsel ist ein wichtiger Virulenzfaktor in vielen Bakterienarten einschließlich K. Pneumoniae3, Streptococcus Pneumoniae9, Acinetobacter10und Neisseria11 Arten. Zwar gibt es verschiedene Methoden zur Quantifizierung und Visualisierung von bakteriellen Kapseln, derzeit gibt es keine weit verbreitete Methode, um körperlich verkapselte und nicht verkapselten Zellen trennen. In diesem Artikel haben wir eine robuste Methode zur Kapsel Gewaltenteilung Bakterienpopulationen mit mehreren möglichen Anwendungen in Verbindung mit verschiedenen vor- oder nachgelagerten Protokollen gezeigt.

Das Vorhandensein einer Oberfläche Kapsel kann bakterielle Zelldichte, reduzieren die Trennung durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Abbildung 2D) ermöglicht. Wir haben diese Methode in K. Pneumoniae NTUH-K204412 und ATCC4381613 sowie Streptococcus Pneumoniae 23F14 und seine Δcps mutierten15validiert. Diese Methode verwendet die Percoll16 als Hauptbestandteil des Dichtegradienten, die eine Aussetzung der beschichteten kolloidale Silica-Partikel, die niedrige Viskosität und keine Toxizität gegenüber Bakterien – im Prinzip, andere Substanzen, die Erfüllung dieser Kriterien hat sein könnte zum Herstellen der Dichtegradient verwendet.

Es kann schwierig sein, sicherzustellen, dass Schichten unterschiedlicher Dichte vermischen sich nicht, wenn Dichtegradienten zu konstruieren, und geschieht mischen, die Trennung Methode nicht saubere Ergebnisse geben. Wir haben zwei alternative Methoden für das Gießen der Steigungen enthalten, mit einer Nadel oder einer Pipette – beide sind wirksam, und die zu verwendende Methode ist einfach eine Frage des Geschmacks. Für alle Schritte, bei denen eine Substanz (entweder eine Bakteriensuspension oder mehr verdünnte Verlaufsebene) über eine Verlaufsebene pipettieren, kann mehrere Aliquote kleinerer Mengen Pipettieren eine scharfe Oberfläche zu erreichen, ohne eine Vermischung der Schichten erleichtern.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass seine Leistung mit anderen Bakterienarten nicht garantiert werden kann. Daher ist es wichtig, bei der Prüfung eine neue Bakterienspezies oder Belastung, die Dichte-basierte Abscheidung mittels einer zusätzlichen, unabhängigen Kapsel Quantifizierungsmethode zu validieren. Visualisierung von Bakterien in jedem Bruchteil von Mikroskopie mit entsprechenden Kapsel Flecken ist eine zuverlässige Methode für die ausführliche Protokolle zur Verfügung17sind. Kapseln mit Uronic Säuren (z. B. von Escherichia coli und K. Pneumoniae) können alternativ mit einer spezifischen Assay quantifiziert werden, wie in Abbildung 2B1dargestellt. Die Zentrifugation-basierte Mucoviscosity-Test eignet sich nicht als unabhängige Validierungsmethode, wie dieser Test auch von der Dichte der bakteriellen Zellen abhängt.

Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist, dass Kapselproduktion reagiert sehr empfindlich auf Kulturbedingungen und selbst kleine Veränderungen auf Wachstumsmedium, Temperatur, Belüftung beeinträchtigen die Ergebnisse dieses Tests. Um dieses Problem zu minimieren, können Forscher eine definierte Wachstumsmedium oder ein Batch-einheitliche komplexe Medium verwenden, halten alle anderen Wachstumsparameter identisch zwischen Experimenten und gehören geeignete Vergleichslinien um die Interpretation der unerwartete Ergebnisse zu ermöglichen . Einige bakterielle Kapseln sind zerbrechlich und können von der Zelle zu scheren, wenn Kulturen pipettiert werden. Um zu vermeiden, die Scheren von Kapseln, sollten Kulturen zentrifugiert und Nukleinsäuretablette nicht mehr als zweimal während der Vorbereitung für das Laden auf den Farbverlauf. Wenn Verlust der Kapsel während der Konzentration der Kulturen problematisch bleibt, Bakterienkulturen können angewendet werden um ein Dichtegradient direkt, mit einem größeren Volumen der Bakteriensuspension hinzugefügt wenn nötig zur Visualisierung.

Zukünftige Anwendungen dieser Methode sind, um ihn auf andere Bakterienarten anzuwenden und diese Trennung in Verbindung mit unterschiedlichen vor- und nachgelagerten Technologien zu verwenden. Neben der Dichte-TraDISort8empfehlen wir, dass gradient Dichtetrennung von verkapselten Bakterien für die Isolierung von Mutanten mit veränderten Kapsel, für die Reinigung der verkapselten Zellen aus Mischkulturen oder komplexen Proben und für verwendet werden könnten schnelle profiling Kapselproduktion in mehrere Stämme. Schließlich könnte diese Technologie verwendet werden, um andere bakterielle Phänotypen wie Aggregation zu untersuchen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Wang Jin-Stadt und Susannah Salter zur Versorgung von Stämmen und Mitglieder des Arbeitskreises Parkhill für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Wellcome Sanger Institute (Wellcome Grant 206194) und durch ein Sir Henry Wellcome-Postdoc-Stipendium für F.L.S. (Grant 106063/A/14/Z) finanziert. M.J.D. wird unterstützt durch ein Wellcome Sanger Institut PhD Zugehörigkeit.

Materials

Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500ml buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15ml tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 – 7ml tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2ml tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5ml tubes Eppendorf 0030 120.086
5ml polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1ml disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips
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References

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– Bacteria Separation- Capsule Amount- Discontinuous Density Gradient- Klebsiella- Capsule Regulation- Visual Demonstration- Density Gradient Medium- Centrifugation- Cell Suspension- Gradient Dilutions- Gradient Interface

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Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).
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