הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע

הערה: ודא כי כל הערכות סיכונים החלים זני חיידקים הם דבקו כאשר culturing וטיפול דגימות. שימו לב כי הקמת מעברי צבע מדי בבת אחת יכולה להוביל בהפרעות שרירים עקב הלחץ על המפרקים מ איטי pipetting מעורב. תוכנית עבודה ולנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע פציעות. 1. הכנת זני חיידקים או ספריות מוטציה פס החוצה הזנים כדי להיבדק על פלטות אגר המתאים. אלה הם לוחות מניות עבור הניסוי. דגירה הלוחות בן לילה על הטמפרטורה הרצויה להשגת קולוניות יחיד. עבור ניסוי זה,, תרבות pneumoniae ק’ (זנים NTUH-K2044 ו- ATCC43816) על אגר מרק (LB) לוריא-37 ° C, ו ס pneumoniae (23F פראי סוג ו- Δ 23Fcps) על אגר דם בתוך צנצנת humidified הנר ב 37 º C. לבחור מושבה בודדת מצלחת מניות (שלב 1.1) לחסן 10 מ ל מרק המתאים באמצעות לולאה סטרילי או מקל קוקטייל. להקרנה של ספריות מוטציה אקראית, לחסן המרק עם 10 µL של המניה ספריית מוטציה אקראית (ספריית טרדיס). דגירה ק’ pneumoniae זנים של תקשורתי LB מלח נמוך ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות, וללחצים ס pneumoniae בתקשורת אינפוזיה (BHI) הלב המוח, באופן סטטי ב 37 º C. להעביר את התרבות לילה צנטריפוגה ומפרידה ספסל-top 10 דקות ב- 3,200 g x במתוך דליים עם 15 מ”ל צינור מוסיף ומכסים חזק תרסיס ובשעות 15 מ”ל. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).הערה: להיפטר supernatant דרך המתאימה נוזלי ביולוגי פסולת המסלול במעבדה. מטרת השלבים צנטריפוגה ו- resuspension (1.2.2 ו- 1.2.3) היא לרכז את החיידקים להמחשת קל במעבר הצבע. תרבויות חיידקי יכול להיטען ישירות על גבי המילוי ההדרגתי אם מועדף. זנים בכבדות capsulated אולי לא בצורת גלולה חזק. במקרה זה, להסיר כמה שיותר תגובת שיקוע ככל האפשר מבלי להסיר תאים חיידקיים, להוסיף 1 x PBS נפח הסופי של 5 מ”ל, resuspend בגדר. המשך הפרוטוקול עם צעד 1.2.5. עבור זנים שאינם-mucoid, עבור לשלב 2. Centrifuge הצינורות כפי שמתואר בשלב 1.2.2. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ ל 1 x PBS. תאים הם עכשיו מוכן לשימוש.הערה: הצפיפות של התליה תא החיידק אינו קריטי, אבל צריך להיות מספיק עבור ויזואליזציה במעבר הצבע. OD המינימלי600 (צפיפות אופטית על 600 ננומטר) של 4 הוא הציע. 2. הכנת דילולים הדרגתיות ובדיקה הדרגתי מיני להכין דילולים הדרגתיות.הערה: ריכוז המדויק של צפיפות בינונית מעבר הצבע (לדוגמה, Percoll) צורך במעברי צבע צפיפות להשיג הפרדה טובה ישתנו בהתאם לתנאים זן וצמיחה בקטריאלי בשימוש. הדרגה מיני בדיקות מבוצעות תחילה, כדי לזהות הריכוזים שתעניק את ההפרדה הטוב ביותר. אלה מהווים µL 500 לדילול יחיד צינור 2 מ”ל. אם חיידקים שחולצו מן המילוי ההדרגתי, subcultured עבור יישומים במורד הזרם, שלבים אלה צריכה להתבצע בתנאים אספטי. משלבים צפיפות בינונית מעבר צבע עם PBS 1 x כדי להפוך דילולים הדרגתי של צפיפות. להפוך דילולים של 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ו- 80% (למשל, 2 מ של צפיפות בינונית הדרגתיות פלוס 8 מ של PBS 1 x = 10 מ”ל של 20% צפיפות בינונית מעבר צבע). Aliquot µL 500 של 20% דילול הדרגתי לתוך צינור 2 mL עבור כל זן להיבדק (למשל, זנים 4 = 4 צינורות המכיל 500 µL של דילול הדרגתי 20%). חזור על שלב 2.1.2 למשך שארית דילולים הדרגתיות. חיידקים חלות על מעבר הצבע. החל µL 100 של תאים חיידקיים שהוכנו בשלבים 1.2.3 ו 1.2.6 לחלק העליון של כל דילול הדרגתי השלבים שלהלן. תופסים µL 100 של תאים באמצעות פיפטה µL 200 ולמקם את הטיפ פיפטה בצד הצינור מתחת במניסקוס מעבר הצבע המצומצמת. האחות של תאים חיידקיים על גבי המילוי ההדרגתי מאוד לאט כך הם יוצרים שכבה על מעבר הצבע, ללא ערבוב של הממשק. חזור על צעדים 2.2.1.1–2.2.1.2 עבור זנים כל להיבדק. באמצעות רוטור זווית קבועה עם מכסה הדוק תרסיס, centrifuge את צינורות מוכנים microcentrifuge 10 דקות ב x 8000 g. לאחר צנטריפוגה, העברת הצינורות מתלה כדי להמחיש דילול הדרגתי המינימלי הנדרש כדי לשמור את התאים בדיוק מעל שכבת צבע בעקבות צנטריפוגה. אם התוצאות אינן ברורות, חזור על מבחן הדרגתי מיני עם בהפרשים של 5% דחיסות צבע בינוני דילולים לעיל, להלן ריכוז מוגדרים צעד 2.1.1 (למשל דילולים 25% ו- 35%, צריך להיבדק אם התוצאה ב- 30% הוא רב-משמעי).הערה: ראה איור 2א לתוצאות טיפוסי-צפיפות יחיד לדילול ההדרגתי בינוני. השתמש התוצאות של צעדים 2.2.3–2.2.4 כדי לקבוע את דילולים הדרגתיות אידיאלי לשימוש כדי להפריד בין תאים ורחבה במעברי צבע רציף. 3. הכנה של תאים הניסוי הראשי הכן טרי תרבויות לילה על ידי מזריקים 10 מ ל מרק המתאים כמתואר בשלב 1.2. דגירה התרבויות ללון בתנאים המתאימים כמתואר בשלב 1.2.1. גלולה התרבות לילה כפי שמתואר בשלב 1.2.2. לשטוף את התאים כפי שמתואר בשלב 1.2.3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ”ל של PBS 1 x. אם המתח הוא mucoid, לא גלולה בקלות, resuspend בגדר של עד 2 מ של PBS או מדיה שיורית. תאים הם עכשיו מוכן לשימוש. 4. הכנה של מעברי צבע צפיפות מקוטע הערה: שיטה חלופית של הכנה הדרגתיות מלמטה (הכי מרוכז) למעלה (לפחות מרוכז) באמצעות פיפטה מתואר בשלב 7. פיפטה 1 מ”ל של דילול הדרגתי צפיפות שתדללו ביותר לתוך פוליפרופילן 5 מ ל סיבוב התחתית התחתונה כדי ליצור את השכבה העליונה, שתדללו ביותר, של מעבר הצבע.הערה: עוקבים שכבות של דילולים מרוכז יותר הדרגתי יתווספו מתחת לשכבה זו באמצעות מחט, כדי לא לשבש את השכבות. מינימום של 2, לכל היותר שלוש שכבות צבע של 1 מ ל כל אחד מומלץ עבור ההפרדה חזקים והדמיה קל של חיידקים. באמצעות מזרק חד פעמיות 1 מ”ל עם מחט 1.5 inch המצורפת, לקחת 1 מ”ל של הבא הכי מרוכז צפיפות צבע בינוני דילול לתוך המזרק. הימנע מלקחת את כל האוויר, כמו בועות יכול לשבש את השכבות ההדרגתי. מקם את קצה המחט בחלק התחתון של הצינור המכיל את השכבה הראשונה. וארוקן את תוכן המזרק לאט מאוד כדי למנוע ערבוב של הממשק.הערה: הממשק של דילולים שני יעלו דילול הדרגתי מרוכז יותר מתווספת. התבונן בממשק על ידי מחזיק אור או חלון חיצוני. אם אין ממשק ייחודי הוא ציין, מחק את מעבר הצבע ולהתחיל שוב. הסר את המחט מעבר הצבע בעדינות כדי לא להפריע הממשק בין דילולים מעבר צבע שונה. מקם את הצינור מתלה מתאים כדי לשמור את זה זקוף. אם באמצעות שלושה דילולים שונים, חזור על השלבים 4.1.1–4.1.2.1 כך דילול הצפוף נמצאת בתחתית. אם המילוי ההדרגתי נבנתה בהצלחה, יהיו שלוש שכבות נפרדות עם כל ערבוב בכל הממשקים. 5. הוספת תאים מוכן מעברי צבע והפרדה על ידי צנטריפוגה להוסיף 600 µL של תאים מוכן מהשלב 3.3 העליון של מעבר הצבע בצינור באיטיות וללא ערבוב הממשק, כפי שמתואר בשלב 2.2. למקם את הצינורות צינור מתאמי ולשקול את מתאמי משולב, צינורות כדי להבטיח שהם מאוזנים. מקום מתאמי שפופרת של הרוטור זווית קבועה בתוך צנטריפוגה ספסל-העליון. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב x 3000 g. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את הצינורות, מקם אותם בתוך ארון תקשורת מתאימים, ולצלם את התוצאות כרשומה. לשחזר את השברים חיידקי על כימות חומצה uronic או מיצוי DNA על-ידי ביצוע בשלב 6. אם יישומי הזרם אינם נדרשים, תשליך דגימות/מעברי צבע באמצעות המתאים נוזלי ביולוגי פסולת המסלול במעבדה.הערה: חשוב לאמת את ההפרדה עבור מינים חדשים/זנים של חיידקים. שברים בודדים של מעבר הצבע צריך להיבדק על ידי מיקרוסקופ, על ידי assay חומצה uronic (שלב 8), או עוד assay כמותיים מתאימים כדי לאשר את ותפקיד קפסולה של כל שבר. אם המטרה היא להפריד על בסיס צבירה או גודל תא, מבחני המתאים עצמאי אמור לשמש. 6. מחלים דוגמת שברים ומספרים שלב תוצר אופציונלי להתאושש השברים מעבר צבע על-ידי הסרת ומחיקת כל הנוזל. דילול העליון אם אין שבר חיידקי קיים בשכבה. כדי להסיר את השבר העליונים, להשתמש פיפטה P200 בעדינות להעביר את הטיפ פיפטה דרך מעבר הצבע השבר ו לקחת את השבר. מקום השבר לתוך צינור 1.5 mL, תווית כראוי. לשחזר שברים נוספים, עדיין באמצעות הפיפטה P200 להוסיף את הטיפ בעדינות דרך מעבר הצבע כדי השבר ולשחזר את השבר לרכבת התחתית mL 1.5 טריים. הסרת צבע עודף כמו השברים למטה מעבר הצבע מתבצעת. אם הדנ א החילוץ של שבר המכיל את מספרי הטלפון הנייד נמוך מאוד תת-תרבות הדרושים (למשל, עבור צפיפות-TraDISort), השבר לפי הפרוטוקול מ שלב 6.2 עבור תוצר אופציונלי להשיג יותר תאים.הערה: תהיה רמה נמוכה של דחויים מתאי בחלק העליון של מעבר הצבע לתוך התחתון שברים, כמו שברים יוסרו מלמעלה עד למטה. למזער את זה על-ידי עבודה בזהירות כדי לא לערבב מעבר הצבע, באמצעות מחט כדי להסיר שברים נמוכה יותר, ועל ידי ביצוע טיהור מחדש נמוך מאוד שפע דוגמאות של איפה דחויים עשויים להשפיע על התוצאות. העברת תאים מן השבר נמוכה-שפע התאושש ב צעדים 6.1.1–6.1.2 אל 5 מ של המדיה המתאימה נוזלי. מניחים בתוך אינקובטור ולגדול עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים של צמיחה או כאשר המדגם הגיעה עם יתר600 של 1, להעביר את התרבות צינור 15 מ”ל. Centrifuge את הצינור 10 דקות ב x 3,200 g ומפרידה עם הנדנדה החוצה דליים ומכסים חזק תרסיס. למחוק את תגובת שיקוע Resuspend בגדר תא ב 1 מ”ל של 1 x PBS. להכין מעבר צבע טרי יחיד-ריכוז צפיפות צינור פוליפרופילן 5 מ. השתמש את הריכוז הדרגתי מפני מעל המיקום של השבר במעבר הצבע המקורי (למשל, עבור טיהור של המוטציהslyA Δ שמוצג באיור 2ד’, 15% צפיפות בינונית הדרגתיות היה לשמש).הערה: שלב טיהור מחדש זה הוא אופציונלי. להחיל את התאים העליונה של מעבר צבע, צנטריפוגה כפי שתואר בשלבים 2.2 ו- 5.1. להסיר את הצינורות לצנטריפוגה ומניחים האצטבה המתאים. לצלם את ההדרגה ולשחזר את השבר להפקת DNA כמתואר ב- 6.1 – 6.1.2.הערה: המדגם מוכן כעת עבור הפקת דנ א או יישומים אחרים של הזרם. 7. שיטה חלופית להכנה הדרגתיות מלמטה (הכי מרוכז) למעלה (לפחות מרוכז) באמצעות פיפטה השתמש את דילולים הדרגתיות שנקבע בשלב 2.2.3. באמצעות פיפטה 1,000 µL, להוסיף 1 מ ל הצפוף דילול הדרגתי שפופרת 5 מ. באמצעות פיפטה 200 µL, הוסף 200 µL של דילול הדרגתי צפופה הבא לאט מאוד לחלק העליון של השכבה בצינור, כדי לא לערבב את הממשק. להוסיף עוד 200 µL ואת ואז סופית 600 µL. הוספת אמצעי אחסון קטן יותר מרובים נותן יותר שליטה על מהירות pipetting, מונע ערבוב של הממשק. אם הממשק מערבב, למחוק ולהתחיל שוב. חזור על שלב 7.1.1 עם ריכוז הדרגה השלישית, לפחות צפוף אם דילולים שלושה משמשות. הצינור צריך כעת מעברי צבע של 2 mL או 3 מ ל בהתאם לתוצאות מהשלב 2.2.3. עבור לשלב 5 של פרוטוקול כדי להוסיף תאים ולהמשיך את הניסוי. 8. מדידה של כמות קפסולה על ידי חומצה Uronic Assay התאימו את יתר600 של כל שבר התאושש ל 4.0 באמצעות דילול עם PBS. להמשיך עם כימות של חומצות uronic כפי שפורסמו בעבר1.