Séparation de bactéries par Capsule montant à l’aide d’un Gradient de densité discontinu

Remarque : S’assurer que les évaluations du risque applicables aux souches bactériennes sont respectées lorsque la culture et la manipulation des échantillons. Sachez que mise en place trop dégradés à un moment donné peut conduire à des troubles musculo-squelettiques dues à la pression sur les joints de la lente pipetage impliqués. Plan de travail et prendre des précautions pour éviter les blessures. 1. préparation des souches bactériennes ou bibliothèques Mutant Rayure sur les souches à tester sur milieu gélosé approprié. Ce sont des plaques de stock pour l’expérience. Incuber les boîtes de nuit à la température voulue pour atteindre les colonies individuelles. Pour cette expérience,, K. pneumoniae (souches NTUH-K2044 et ATCC43816) la culture sur gélose de bouillon (LB) de Luria à 37 ° C et S. pneumoniae (type sauvage 23F et 23F Δcps) sur gélose au sang dans un bocal de bougie humidifiée à 37 ° C. Choisir une seule colonie d’une plaque de stock (étape 1.1) pour ensemencer 10 mL de bouillon approprié à l’aide d’une anse stérile ou un bâtonnet. Pour le criblage de bibliothèques mutants aléatoires, ensemencer avec 10 µL du stock aléatoire bibliothèque mutante (bibliothèque TraDIS). Incuber les souches de Klebsiella pneumoniae dans les milieux LB sel peu à 37 ° C sous agitation et les souches de S. pneumoniae dans les médias de perfusion (BHI) coeur cerveau, statiquement à 37 ° C. Transférer la culture pendant la nuit dans un tube de 15 mL et centrifugeuse dans une centrifugeuse de paillasse pendant 10 min à 3 200 g x bat les seaux avec inserts de tube de 15 mL et couvercles hermétiques aérosol. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).Remarque : Disposer de surnageant via la voie des déchets biologique liquide appropriée dans le laboratoire. Les étapes de centrifugation et de la remise en suspension (1.2.2 et 1.2.3) vise à concentrer les bactéries pour faciliter la visualisation sur le gradient. Cultures bactériennes peuvent être chargés directement sur le dégradé, si vous préférez. Souches fortement capsulées peuvent ne pas faire une boulette serrée. Dans ce cas, retirer autant surnageant possible sans enlever toutes les cellules bactériennes, ajoutez 1 x PBS pour un volume final de 5 mL et resuspendre le culot. Continuer le protocole avec étape 1.2.5. Pour les souches non-mucoïde, passez à l’étape 2. Centrifuger les tubes comme indiqué au point 1.2.2. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de PBS 1 x. Les cellules sont maintenant prêtes à l’emploi.Remarque : La densité de la suspension de la cellule bactérienne n’est pas essentielle, mais doit être suffisante pour la visualisation dans le gradient. Un minimum de l’OD600 (densité optique à 600 nm) de 4 est suggéré. 2. préparation des Dilutions dégradées et gradient mini Test Préparer des dilutions en dégradé.Remarque : Les concentrations exactes du milieu gradient de densité (p. ex., Percoll) nécessaires dans les gradients de densité pour atteindre la bonne séparation différera en fonction des conditions de déformation et de la croissance bactériennes utilisées. Pente mini épreuves sont tout d’abord, afin de déterminer les concentrations qui donneront la meilleure séparation. Elles composent de 500 µL d’une seule dilution dans un tube de 2 mL. Si les bactéries seront extraites du gradient et repiqués pour applications en aval, ces étapes devraient être effectuées dans des conditions aseptiques. Combiner les milieu de gradient de densité avec 1 x PBS pour faire des dilutions de gradient de densité. Préparer des dilutions de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % et 80 % (par exemple, , 2 mL de densité moyen dégradé plus 8 mL de PBS 1 x = 10 mL de milieu gradient de densité 20 %). Aliquote 500 µL de la dilution de dégradé de 20 % dans un tube de 2 mL pour chaque souche à tester (par exemple, 4 souches = 4 tubes contenant 500 µL de dilution dégradé de 20 %). Répétez l’étape 2.1.2 pour le reste des dilutions dégradés. Appliquer les bactéries au dégradé. Déposer 100 µL de cellules bactériennes, préparé à l’étape 1.2.3 et 1.2.6 jusqu’au sommet de chaque dilution dégradé suivant les étapes ci-dessous. Prendre 100 µL de cellules à l’aide d’une pipette µL 200 et placer l’embout de la pipette sur le côté du tube juste en dessous le ménisque du gradient mini. Aspirer les cellules bactériennes sur le gradient très lentement afin qu’elles forment une couche sur le dessus de la pente, sans n’importe quel mélange de l’interface. Répétez les étapes 2.2.1.1–2.2.1.2 pour toutes les souches à tester. À l’aide d’un rotor à angle fixe avec un couvercle hermétique de l’aérosol, centrifuger les tubes préparés dans une micro-centrifugeuse pendant 10 min à 8 000 x g. Après centrifugation, transférer les tubes dans un rack de visualiser la dilution gradient minimale requise pour conserver des cellules juste au-dessus du calque graduel après centrifugation. Si les résultats ne sont pas clairs, répéter l’essai de la mini-gradient avec incréments de dilutions moyennes gradient de densité 5 % ci-dessus et inférieure à la concentration définie dans l’étape 2.1.1 (p. ex., 25 % et 35 % des dilutions doivent être testées si le résultat de 30 % est ambigu).Remarque : Voir la Figure 2A pour résultats typiques à une dilution moyenne gradient de densité unique. Utiliser les résultats des mesures 2.2.3–2.2.4 pour déterminer les dilutions de dégradé idéales à utiliser pour séparer les cellules à plus grande échelle des gradients discontinus. 3. préparation des cellules pour l’expérience principale Préparer des cultures fraîches pendant la nuit en inoculant 10 mL de bouillon approprié tel que décrit à l’étape 1.2. Incuber les cultures pendant la nuit dans des conditions appropriées, comme indiqué au point 1.2.1. Comme indiqué au point 1.2.2 de granule la culture pendant la nuit. Laver les cellules tel que décrit à l’étape 1.2.3. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 1 x. Si la souche est mucoïde et ne pas facilement pellet, resuspendre le culot dans jusqu’à 2 mL de PBS ou restes de fluides. Les cellules sont maintenant prêtes à l’emploi. 4. préparation des Gradients de densité discontinu Remarque : Une autre méthode de préparation dégradée du bas (les plus concentrés) en haut (moins concentré) à l’aide d’une pipette est décrit à l’étape 7. Pipette 1 mL de la dilution de gradient de densité plus diluée dans un polypropylène 5 mL rond tube inférieur pour former la couche supérieure, plus diluée, du dégradé.Remarque : couches subséquentes de dilutions dégradées plus concentrées seront ajoutés sous cette couche à l’aide une aiguille, de manière à ne pas pour perturber les couches. Un minimum de deux et trois couches de gradients de 1 mL chacun au maximum sont recommandés pour la séparation solide et une visualisation facile des bactéries. À l’aide d’une seringue jetable 1 mL avec une aiguille de 1,5 pouce attachée, prendre 1 mL de la prochaine plus concentrée densité gradient moyenne dilution dans la seringue. Évitez de prendre n’importe quel air, comme les bulles peuvent perturber les couches dégradés. Placer l’extrémité de l’aiguille au fond du tube contenant la première couche. Aspirez le contenu de la seringue très lentement pour éviter de mélanger l’interface.Remarque : L’interface des deux dilutions se lèvera comme la dilution dégradée plus concentrée est ajoutée. Observer l’interface en le tenant à la lumière ou à l’extérieur d’un fenêtre. Si aucune interface distincte n’est observée, jetez le gradient et recommencer. Retirez l’aiguille du gradient très doucement pour ne pas déranger l’interface entre les différentes dilutions dégradées. Placer le tube dans un support approprié pour le maintenir debout. Si vous utilisez trois différentes dilutions, répétez les étapes 4.1.1–4.1.2.1 afin que la dilution plus dense se trouve au bas. Si la pente a été construite avec succès, il y aura trois couches distinctes avec aucun mélange aux interfaces. 5. ajouter des cellules préparées à dégradés et séparation par Centrifugation Ajouter 600 µL de cellules préparées à l’étape 3.3 vers le haut du dégradé dans le tube très lentement et sans mélange de l’interface, comme indiqué au point 2.2. Placer les tubes dans les adaptateurs de tube et peser les adaptateurs combinés et les tubes pour s’assurer qu’ils sont équilibrés. Placer les adaptateurs tube dans un rotor à angle fixe dans une centrifugeuse de paillasse. Centrifuger pendant 30 min à 3 000 x g. Après centrifugation, retirez délicatement les tubes, placez-les dans un panier adapté et photographier les résultats sous forme d’enregistrement. Récupérer les fractions bactériennes pour dosage acide uronique ou extraction de l’ADN en suivant l’étape 6. Si les applications en aval ne sont pas nécessaires, éliminer les échantillons/dégradés via l’itinéraire des déchets biologique liquide approprié dans le laboratoire.Remarque : Il est important de valider la séparation pour les nouvelles espèces/souches de bactéries. Différentes fractions de dégradé devraient être examinées au microscope, par dosage acide uronique (étape 8), ou un autre test quantitatif approprié pour confirmer le phénotype capsule de chaque fraction. Si le but est de séparer la fonction d’agrégation ou de la taille des cellules, des dosages appropriés indépendants doivent servir. 6. récupération des Fractions de l’échantillon et l’excroissance optionnel Step Récupérer les fractions d’un gradient en enlevant et en jetant tout liquide à partir de la dilution supérieure si aucune fraction bactérienne n’est présente au sein de cette couche. Pour enlever une fraction supérieure, utiliser une pipette de P200 et doucement passer l’embout de la pipette dans le gradient de la fraction et prennent la fraction. Déposer la fraction dans un tube de 1,5 mL et étiqueter correctement. Pour récupérer les autres fractions, toujours à l’aide de la pipette P200, insérez la pointe doucement à travers le gradient, la fraction et récupérer la fraction d’un tube frais de 1,5 mL. Enlever excès dégradé comme les fractions plues bas du gradient sont accessibles. Si l’extraction de l’ADN d’une fraction contenant un nombre très faible de cellules est nécessaire (par exemple, pour la densité-TraDISort), sous-culture la fraction en suivant le protocole de l’étape 6.2 pour l’excroissance facultatif obtenir plus de cellules.Remarque : Il y aura un faible niveau de contamination des cellules en haut de la pente en fractions inférieures, comme fractions sont supprimées du haut vers le bas. Réduire au minimum ceci en travaillant avec soin pour ne pas mélanger le dégradé, en utilisant une aiguille pour enlever des fractions plus bas et en effectuant des re-purification des échantillons de très faible abondance où report peut affecter les résultats. Cellules de transfert de la fraction de faible abondance récupérés dans les étapes 6.1.1–6.1.2 dans 5 mL de milieu liquide approprié. Placer dans un incubateur et grandir pendant 2 h à 37 ° C. Après 2 h de croissance ou lorsque l’échantillon a atteint une OD600 des 1, transférer la culture dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube pendant 10 min à 3 200 x g dans une centrifugeuse avec swing, seaux et couvercles hermétiques aérosol. Jeter le surnageant Resuspendre le culot dans 1 mL de solution 1 PBS x. Préparer un gradient de densité de concentration unique fraîche dans un tube en polypropylène 5 mL. Utiliser la concentration gradient de juste au-dessus de l’emplacement de la fraction dans la pente initiale (par exemple, pour la purification du mutantslyA Δ illustré à la Figure 2D, gradient moyen de 15 % densité serait utilisé).Remarque : cette étape de re-purification est facultative. Appliquer les cellules vers le haut de la pente et centrifuger comme décrit aux points 2.2 et 5.1. Retirer les tubes de la centrifugeuse et le placer dans un support approprié. Photographier le gradient et récupérer la fraction pour l’extraction de l’ADN comme décrit dans 6.1 – 6.1.2.Remarque : L’échantillon est maintenant prêt pour l’extraction d’ADN ou d’autres applications en aval. 7. autre méthode de préparation dégradée du bas (les plus concentrés) en haut (moins concentré) à l’aide d’une Pipette Utiliser les dilutions gradients déterminées à l’étape 2.2.3. À l’aide d’une pipette µL 1 000, ajouter 1 mL de la dilution dégradée plus dense dans un tube de 5 mL. À l’aide d’une pipette de 200 µL, ajouter 200 µL de la dilution suivante de gradient dense très lentement vers le haut de la couche dans le tube, de manière à ne pas mélanger l’interface. Ajouter un autre 200 µL et ensuite la finale 600 µL. ajoutant plusieurs petits volumes donne plus de contrôle de vitesse de pipetage et empêche le mélange de l’interface. Si l’interface mixes, jeter et recommencer. Répétez l’étape 7.1.1 avec la troisième, moins dense concentration gradient si trois dilutions sont utilisées. Le tube doit avoir maintenant des gradients de 2 mL ou 3 mL en fonction des résultats de l’étape 2.2.3. Passez à l’étape 5 du protocole à ajouter des cellules et de poursuivre l’expérience. 8. mesure de la quantité de Capsule par dosage de l’acide Uronique Ajuster l’ OD600 de chaque fraction récupérée vers 4.0 par dilution avec du PBS. Procéder à la quantification des acides uroniques comme précédemment publiés1.