Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

1. hazırlanması çözümleri ve Kimyasalları Tam insan Endothelial-SFM Orta (EC-SFM tam) trombosit-yoksul plazma elde edilen serum (% 1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng/mL) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF, 50 ng/mL) insan Endothelial-SFM (görmek tablo ekleyerek hazırlamak Malzemeler). Orta 0,22 µm gözenek filtre ile filtre ve 4 ° C’de 2 hafta için saklayın. Fetal Sığır serum (% 10), ekleyerek tam RPMI orta hazırlamak 2-mercaptoethanol (0,05 nM), L-glutamine (% 1), penisilin-streptomisin (25 U/mL) RPMI Orta ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C’de 3 haftaya kadar saklayın. 2. kaplama mikrosıvısal fişleri Steril biochip 10 cm steril Petri kabına yerleştirin. Fibronektin çalışma çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 +/Mg2 + 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için hisse senedi çözümde başlamaktan tarafından hazırlayın. Çalışma çözüm biochip başına 80 µL tahmin ediyoruz. Fibronektin çalışma çözüm 10 µL biochip her kanal enjekte. Bir pipet ile küçük 10 µL ipuçlarını kullanın ve kanal giriş ve Pipet Ucu (Şekil 1 c, sol) arasında sıkı bir temas kurmaya emin olun. Biochip içeren Petri kabına kapağını kapatın ve bir oksijen odası (Şekil 2B) yerleştirin. Gecede odası 4 ° C’de depolayın. Odası nemlendirmek için temiz bir kağıt mendil oksijen odasının altındaki yer ve 5 mL steril H2O. ekleyin Önce tahlil, ertesi gün önceden biochip kuluçka 37 ° C’de ısıtın. 3. hiPSC-ECs hazırlanması Not: Burada açıklanan iletişim kuralında, hiPSC-ECs farklılaşmış, saf, cryopreserved ve yukarıda açıklanan8olarak çözdürülen. Tezcan ve plaka hiPSC-ECs içinde tam EC-SFM tam bir %0,1 jelatin kaplı T75 şişesi, üç dört gün önce tahlil içine. EC-SFM 10 ng/mL ile TNFα takıma tam ekleyerek hiPSC-ECs ile TNFα gecesi öncesinde tahlil, teşvik ve kuluçkaya geceleme (~ 12 h) yukarıda açıklanan 7olarak 37 ° C’de. 4. hiPSC-ECs ayrılma ve tohumlama mikrosıvısal çip içine Tahlil gününde, hiPSC-ECs şişeye kuluçka makinesi almak ve hücrelerin mikroskop altında incelemek. HiPSC-ECs % 80 – 100 birleşmesi ve tipik bir EC benzeri morfoloji var emin olun. Şişeye hücre kültür kapağın aktarın. HiPSC-ECs şişeye ortamından Aspire edin. Kısaca hücre kültürü PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin. 4 mL şişe 1 x ayrılma enzim başına ekleyin. (RT) (Şekil 1B) Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Ayrışma reaksiyonu 8 mL şişe başına insan Endothelial-SFM orta ekleyerek durdurmak. Yavaşça bağlantısını kesin ve hiPSC-ECs süspansiyon 5 mL pipet kullanarak 15 mL konik tüp içinde toplamak. Toplam süspansiyon hücreleri sayar. 300 x g 3 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant Aspire edin ve 1.5 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için hücre Pelet EC-SFM tam resuspend. Kuluçka makinesi üzerinden biochip ile Petri kabına çıkar ve hücre kültür hood için transfer. Fibronektin çözüm mikrosıvısal çip Tüm kanallardan Aspire edin. Hücre süspansiyon 6 µL bir pipet ile bir küçük 10 µL ucu (Şekil 1 c, orta) kullanarak her kanal içine enjekte. Hücre süspansiyon de enjeksiyon önce karıştırılır emin olun ve hücre yağış kaçının. Biochip mikroskop altında incelemek ve hücrelerin eşit şekilde dağıtılır ve hücre yoğunluğu yüksek olduğundan emin olun (Şekil 2C). 37 ° C’de 15 dakika biochip kuluçkaya EC-SFM FULL of 40 µL orta rezervuar içine her kanal her iki taraftan ekleyin. Biochip 37 ° C’de (Şekil 1 c, sağ) 1 h için kuluçkaya. EC-SFM FULL of başka bir 50 µL rezervuarlar içine her kanal her iki taraftan ekleyin. 5. insan lökosit hazırlanması Not: Burada açıklanan protokolünde bir piyasada bulunan Monositik hücre satır (THP-1) kullanıldı. Alternatif olarak, periferik kan mononükleer hücreler veya nötrofil kullanılabilir. Yalıtım periferik kan monosit ve nötrofil standart prosedür11kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bir hücre kültür başlıklı bu paragrafta açıklanan tüm adımları gerçekleştirin. Lökosit 50 mL konik tüp içinde toplamak. Lökosit PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. 300 x g RT (Şekil 1 d) adlı 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet PBS 1 ml DiOC6 boya ile resuspend (λex 485 = nm, λem 501 = nm) (1:5, 000). 10 dk RT. az karanlık hücrelerde kuluçkaya Lökosit PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. Hücreleri 300 x g RT. tekrar çamaşır adım 3 dakika için de bir kez daha santrifüj kapasitesi. Toplam süspansiyon hücreleri sayar. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 2. 5 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon tam RPMI orta resuspend. 6. mikrosıvısal pompa hazırlanması 8-kanal manifold mikrosıvısal pompalı bir araya getirin. Pompa yüklü işletim yazılımı ile bir bilgisayara bağlayın. Mikrosıvısal yazılım başlatın ve Açık protokol tıklatarak iletişim kuralını yükleyin ve üstünde belgili tanımlık PC mikrosıvısal protokolü seçin gidin. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ve pompa Kurulum klasörünü seçip Tahlil adım Çalıştır’ıtıklatarak bağlanın. Doğru akış hızı denetimi kanallarda geometrisini tanımlar: Güncelleştirme geometri Geometri Kur klasöründe seçin ve Tahlil adım Çalıştır’ıtıklatın.Not: Geometri ayrıntıları şırınga ve kullanılacak kanallar aynı olduğundan emin olun (geometri kimliği = 1, kanal sayısı = 8, kanal genişliği 800.0 µm, Kanal derinliği = 120.0 µm, şırınga hacmi = 250 µL =) ve örnek viskozitesi (sıvı viskozitesi = 1,0). Pompa giriş kablosu (turuncu) yerleştirerek etanol içeren 50 mL konik tüp yıkayın. Çıkış kablosu (yeşil) 50 mL konik boş tüp (atık konteyner) yerleştirin. Silinerek geçiş/pompa silinerek geçiş klasörü seçin ve Tahlil adım Çalıştır’ı tıklatın (yıkayın cilt 2000 µL, yıkama birim adım = 250 µL, silinerek geçiş yön = çıkış =). Bir kez daha çamaşır adımı yineleyin. Adımlarla (adım 6,6-6,7), hücre kültürü sınıf su ve insan Endothelial-SFM kültür orta yıkama pompası yineleyin. Manifold yıkama adımıyla devam edin. El ile vana şırınga ve manifoldu arasında yanında duvar ilanı 3-şekilde bağdaştırıcı doğru konuma (sola döndü OFF göstergesi) açın. Küme geçerli kanal/açık adım Silinerek geçiş/Manifold yıkama klasörü seçin ve manifold bütün vanaları açmak için Çalıştırmak tahlil adım ‘ ı tıklatın. Manifold el ile 5 mL hücre kültür sınıf su takip şırıngadan 5 mL % 80 etanol de iterek yıkayın. Manifold şırıngadan insan Endothelial-SFM kültür orta 5 mL iterek yıkayın. Manifold içinde sıkışıp kalırlar tüm büyük hava kabarcıkları kaldırın. Bunu yapmak için 10 cm Petri kabına orta ile 8-şey PIN bağdaştırıcısı yerleştirin ve tüm büyük hava kabarcıkları yok olana şırınga ile itme/çekme gerçekleştirmek (küçük baloncuklar bir sorun değildir). Silinerek geçiş/Manifold yıkama klasöründe Kümesi geçerli kanal/kapat adımını seçin ve manifold bütün vanaları kapatmak için Çalıştırmak tahlil adım ‘ ı tıklatın. Yeşil çıkış kablosunu pompası manifold bağdaştırıcısına bağlayın. 3-yollu vana şırınga kapatmak için tekrar OFF konumuna geçin. Silinerek geçiş/kablo silinerek geçiş klasörü seçin ve tek tek, her bağlantı noktası RPMI orta ile yıkamak için Tahlil adım koşmak tüm kabarcıklar her kablo kaldırılır kontrol ettikten tıklatın (birim dağıtmak 100 µL =).Not: Manifold her Vana teker teker açılan, diğer kanallar tutmak kapalı iken 1 8 ve 100 μL orta için tek tek her kanalı ile reçete. Sıvı her iğnesinden yayınladığından emin olun. Hiçbir sıvı ortaya çıkıyor, bir hava kabarcığı veya bir takunya belirtisi tek. 7. mikrosıvısal çip için hazırlanması canlı görüntüleme Mikrosıvısal kurulumları hazırız ve canlı görüntüleme odası 37 ° C için önceden dengelenmiş ve %5 (Şekil 3A, B) CO2 düzeyine ulaşır emin olun. Biochip kuluçka makinesi almak ve mikroskop çip tutucu içinde konumlandırın. Chip sahibi sahne (Şekil 3 c) görüntüleme mikroskobunun bağlayın. Biochip pompa manifold üzerinden bağlanmak için 8 pinlik bağdaştırıcı çip çıkış rezervuar yakın yerleştirin ve orta tüm pins derinleştirmek olmakla birlikte tamamen bağlamayın. Silerek geç seçin | Çip için bağlamak klasör ve tıklayın çip bağlanma öncesi RPMI orta dağıtmak için Tahlil adım çalıştırmak (birim dağıtmak 30 mL =). Bir kez orta reçete, 8 pinlik bağdaştırıcı biochip prize takın.Not: Bu adımda, tüm kanallar üzerinde (açık) ayarlanır ve orta 30 µL her kanalı ile reçete ve bu kanalları (kapalı) kapalı olarak ayarlanır. Bu baloncuklar mikrosıvısal çip kanallarına tanıtılacaktır hava sağlar. El ile bir pipet ile biochip tüm giriş rezervuarlar ortamından Aspire edin. Silerek geç seçin | Chip silinerek geçiş ağıl ve tıkırtı her bir-yanında-kanaldan ölü hücreler/enkaz kurtulmak için bir kanal aracılığıyla EC-SFM tam orta 40 mL sıvı için Tahlil adım çalıştırmak (silinerek geçiş cilt 40 µL, maksimum silinerek geçiş kesme = 40 dynes/cm2=). 8. akış yapışma tahlil ve görüntü edinme El ile ilgi bir pipet ile kanal giriş rezervuarı ortamından Aspire edin. Lökositlerin 100 µL adım 5.6 ilgi kanal giriş rezervuarı ekleyin.Not: Hücreleri tek hücre süspansiyon yapmak karışımı yavaşça. Hücre tahlil | Adım açıklama klasörü, Küme geçerli kanal/adım açıklamasını seçin ve, ilgi sadece geçerli kanal kanal listesinde seçin ve On (açık) ayarlayın ve tüm diğer yedi kanallar (kapalı) Off için ayarla. Hücre tahlil seçin | Adım açıklama ağıl ve tıkırtı Tahlil adım çalıştırın.Not: Değişken akış hızı dağıtımı 5 min için kanal üzerinden giriş rezervuar lökosit süspansiyon çekmek için sürekli negatif basınç geçerli olduğunu emin olun (Shear kümesi = sabit, yamultma stres = -0,5 din/cm2, süre = 00:05:00, Gecikme inceden inceye gözden geçirmek = 00:00:00). Yamultma stresin negatif değer akışının doğru yönü sağlar. Giriş rezervuar kalan lökosit Aspire edin. Tam RPMI orta 100 µL giriş havzanın ekleyin. Hücre tahlil/adım açıklama klasörü seçin ve tüm sigara yapışık lökosit yıkamak için kanal RPMI orta ile 5 min için sıvı için Tahlil adım çalıştırmak tıklayın (Shear kümesi = sabit, yamultma stres -0,5 din/cm2, süre = = 00: 05:00, tarama gecikme = 00:00:00). En az 3-4 farklı pozisyonlar (temsilcisi alanları yakalanır emin olmak için) yapıştırılır lökosit görüntüye kanalının görüntülerden elde etmek. 8.1-8.7 kanallar tüm kalan işlev değerlendirmesi için yineleyin.Not: Aynı anda birden fazla kanal çalıştırmak mümkündür. Bunu yapmak için adım 8.3 sırasında ilgi tüm kanallarını açın. ve tüm yukarıda belirtilen adımları 8.4 –8.7 faiz birden fazla kanal için gerçekleştirin. 9. tahlil tamamlanıyor ve mikrosıvısal pompa temizleme Deneme işlemini tamamladıktan sonra verebilir ve tüm görüntüleri RAW formatta kaydedebilirsiniz. Sonuçları kaydedilirken, mikrosıvısal pompa ve protokol temizlik manifold çalıştırın. Mikrosıvısal pompa için koşmak Silinerek geçiş/pompa silinerek geçiş ağıl ilk hücre kültür sınıf su 4 mL ventriküler tarafından % 80’i 4 mL tarafından takip 6,6-6,7 adımlarda açıklandığı gibi etanol makinası pompa birkaç dakika hava çalıştırarak. Manifold temizlemek için şırınga ile Silinerek geçiş/Manifold yıkama adım çalıştırın. Şırınga ve manifold boru hattı betonarme donatı olarak açıklandığı adımlar 6.10-6.11 yıkama % 80 etanol ile ilk ve sonraki hücre kültür sınıf su ile açmak için adımları izleyin. Manifold hava yolu ile belgili tanımlık tenkıye iterek kuru. Şırınga Vana ve manifold vanalar adımları 6,10 ve 6.15 bölümünde açıklandığı gibi kapatın. 10. yapisan lökosit sayma Karşıdan yükleyip görüntü işleme yazılımı14 http://cellprofiler.org.Not: Görüntü bu çalışmada işleme yazılımı sürüm 2.1.1 kullanılarak gerçekleştirildi. Daha yeni bir sürümü kullanıyorsanız, boru hattı küçük uyum gerektirebilir. Boru hattı Count_leukocytes.cpipe. indir Dosyasını tıklatın | Alma | Boru hattı dosyasından ve boru hattı Count_leukocytes.cpipeseçmek için PC’de gidin. Sürükle ve bırak giriş modülleri dosya listesi penceresinde yapisan lökositlerin alınan ham görüntüleri ile bir klasör | Görüntüleri analiz için bölüm. Lökosit analiz modülleri ile tipik boyutunu belirtmek | IdentifyPrimaryObjects. Minimum ve maksimum çapı yapisan lökositlerin piksel olarak belirtin. Analiz modülleri ile filtre uygulama ölçütlerini seçin | FilterObjects. Nesnelerin en az kabul edilen alan piksel olarak belirtin. Analiz analiz görüntüleri düğmesine basarak başlatın.Not: PİŞMEMİŞ imge işleme alınacaktır ve sonuçları bir varsayılan çıkış klasöründe kaydedilir. Image.txt çıkış dosyası (bir resim, yani, her alınan görüş alanı her sayı karşılık gelir) işlenmiş her görüntü yapisan lökosit sayıları içeren.