والرزن موائع جزيئية "تقييم التصاق الكريات البيض" إلى "خلايا بطانية" المستمدة من "الخلايا الجذعية Pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان" (هيبسك-ECs)
Summary
يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية وتحليل البيانات لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك والتحليل لالتصاق الكريات البيض تحت تدفق الفسيولوجية.
Abstract
خلايا بطانية (ECs) ضرورية لتنظيم الردود الملتهبة بالحد أو تسهيل تجنيد الكريات البيض في الأنسجة المتأثرة عن طريق سلسلة جيدا تتسم مستقبلات المؤيدة مادة لاصقة وأوبريجولاتيد على سطح الخلية الكريات البيض على الزناد التحريضية. ردود تحريضية تختلف بين الأفراد في السكان والخلفية الوراثية يمكن أن تسهم هذه الاختلافات. الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) أظهرت أن تكون مصدرا موثوقاً ل ECs (هيبسك-ECs)، مما يمثل مصدر غير محدود من الخلايا التي تعكس الهوية الوراثية وأي المتغيرات الجينية أو الطفرات للجهات المانحة. ولذلك يمكن استخدامها هيبسك ECs لنمذجة ردود التهاب في الخلايا الخاصة بالجهات المانحة. يمكن على غرار الردود الملتهبة بتحديد التصاق الكريات البيض إلى هيبسك ECs تحت تدفق الفسيولوجية. يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية وتحليل البيانات لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك والتحليل لالتصاق الكريات البيض تحت تدفق الفسيولوجية.
Introduction
التهاب يلعب دوراً محوريا في العديد من الحالات المرضية، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية واضطرابات الأعصاب والإنتان والردود السلبية للمخدرات (تقييمات). خلايا بطانية (ECs) تلعب دوراً أساسيا في تنظيم استجابات التحريضية عبر استحثاث المستقبلات المؤيدة لاصقة، مثل التصاق سيليكتين ه، وبين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1) وخلايا الأوعية الدموية التصاق جزيء-1 (VCAM-1) على سطحها 1 , 2-ECs ميكروفاسكولار في أنسجة مختلفة من المعروف أن يحمل عدم التجانس في ردود تحريضية3،4. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي الخلفية الجينية أو بعض الأمراض الوراثية في الفروق في الاستجابات التحريضية بين الأفراد؛ ولذلك من المهم للوصول إلى ECs من مختلف الأفراد. أكثر مؤخرا, البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسكس)5، التي يمكن أن تستمد من أي فرد، وعرضت لتكون بمثابة مصدر موثوق والمتجددة ECs6،،من78، 9-ولذلك، تقييم الاستجابات التحريضية وتجنيد الكريات البيض في ECs هيبسك هو قيمة، ليس فقط لوضع نماذج لبعض الاضطرابات الوراثية، بل أيضا لتوفير مؤشرات التباين بين الأفراد واستخدامها كأداة ل شخصية الطب في المستقبل.
فحوصات تدفق توفر أداة مفيدة لدراسة التفاعل غشائي الكريات البيض. التقدم في مجال أجهزة موائع جزيئية تمكين استنساخ ظروف تدفق السوائل الفيزيولوجية مع مراقبة دقيقة لمستويات الإجهاد القص الخاصة بسرير الأوعية الدموية. تصوير الحية يتيح رصد سلسلة الأحداث لالتقاط الكريات البيض، المتداول، والزحف، والالتصاق والتهجير. تم وضع عدة فحوصات تدفق لدراسة التفاعل غشائي الكريات البيض، بيد أنهم جميعا الاستفادة من الابتدائي ECs10،،،من1112،13. هنا، ونحن سوف تصف بالتفصيل التحليل لتقييم التصاق الكريات البيض البشرية إلى ECs هيبسك تحت تدفق الفسيولوجية. في هذا الإجراء، يصف لنا الظروف الأمثل للتحفيز هيبسك-المفوضية الأوروبية مع المحفزات برو التحريضية، مثل عامل نخر الورم ألفا (TNFα)، الانفصال، البذر في رقاقة موائع جزيئية مع ثماني قنوات موازية. وصف بروتوكول خطوة بخطوة التروية ECs هيبسك مع تعليق الكريات البيضاء المسمى فلوريسسينتلي في رقائق موائع جزيئية، نعيش تصوير الخلية والآلي عد الكريات البيضاء ملتصقة.
هذا البروتوكول مفيدة لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك في فحص المخدرات والنمذجة المرض ويشخص الطب التجديدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول وصف العلاج هيبسك-المفوضية الأوروبية مع المحفزات برو التحريضية، مثل TNFα، تقييم وظيفي لالتصاق الكريات البيض إلى هيبسك-ECs في تحليل تدفق استخدام التصوير الحي والعد الآلي من الكريات البيضاء ملتصقة.
النتائج بين عشية وضحاها حفز ECs هيبسك مع TNFα في مظهر ممدود تشير عادة النمط الظاهري برو تحريضية المنشط في ECs. خلال مرحلة التحسين، ينصح التعبير ينبغي التحقق من مستويات سيليكتين ه، المتكاملة-1، VCAM-1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية7،8, والوريد السري البشرية الأولية ECs (هوفيكس) لإدراجها كعناصر إيجابية.
ينبغي التوصل إلى الانفصال ECs هيبسك الأمثل وبذر الكثافة لتحقيق أحادي الطبقة المتلاقية دون تشكيل كتل الخلايا وقناة قباقيب. من المهم إعادة تعليق حق الكريات البيضاء قبل التروية بغية تجنب ترسيب الخلايا والحفاظ على تركيز ثابت عند المعايرة كل قناة. الكريات البيضاء في الدم المحيطي البشري، مثل وحيدات والعدلات يمكن استخدامها، أو إنشاء خطوط الخلايا مونوسيتيك، مثل THP-1 أو HL-60 يمكن أن تستخدم كبديل.
أثناء الجمعية العامة للإعداد موائع جزيئية وأثناء تحليل التدفق، من المهم للحيلولة دون الوقوع في موائع جزيئية الأنابيب والقنوات كما أنها يمكن أن ينتج المفرزة من ECs هيبسك و/أو الكريات البيضاء ملتصقة فقاعات الهواء. واجهة السائل للسوائل أو إدراج الخطوات الإضافية الغسيل أثناء إعداد الإعداد موائع جزيئية يمكن أن تساعد على منع فقاعات الهواء.
فمن المستحسن أن البروتوكول هو تشغيل اثنين من المشغلين حيث تعد إحدى الخلايا والثاني يعد فحص النظام وتدفق موائع جزيئية. وهذا ما يضمن أن ECs هي مطلي في رقائق موائع جزيئية داخل إطار زمني ثابت قبل تجهيزها، ويحسن من دقة وإمكانية تكرار نتائج نتائج. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح ذلك أيضا لإقامة تجارب أعمى لتجنب التحيز في النتائج.
للكشف عن الخلية الناجحة مع الصورة الآلي تجهيز خط الأنابيب، من المهم للحصول على الصور في التركيز مع ارتفاع نسبة إشارة إلى الضجيج وتجنب أوتوفلوريسسينسي كائنات غير محددة، مثل كتل الخلية. من الأهمية بمكان هو مواصفات الصحيح للحدود الدنيا والقصوى لحجم نموذجي من الكريات البيضاء ملتصقة بحاجة إلى تحديد. واحد يمكن تقدير حجم نموذجي من الكريات البيضاء باستخدام أداة قياس خط في إيماجيج. على سبيل المثال، في تحليلنا، قمنا باستخدام المجموعة من 9 – 15 بكسل الذي يتوافق مع حجم الفعلية من 10.3 – 17.1 ميكرومتر (الشكل 4). عند استخدام مجموعة خاطئة، مثلاً، 3 – 15 بكسل (3.4 – 17.1 ميكرومتر)، يتم تعريف من الكريات البيض واحدة ليس كخلية واحدة، ولكن بدلاً من ذلك يتم تحديد المتبقيتان لها ككائنات منفصلة (الشكل 4). هذا يؤدي إلى كاذبة عدد الكائنات تحديدها.
المساحة العديد من الكائنات كثافة منخفضة وأصغر مما قد يكون الكشف عن الكريات البيضاء باستخدام الأسلوب العتبة التكيفية المقدمة. قد يستغرق هذا المكان بسبب أوتوفلوريسسينسي أو أي إشارات مضيئة أخرى غير محددة. ومع ذلك، هذه الكائنات غير محددة، إذا منطقتهم أقل من منطقة نموذجية الكريات البيض واحدة، يمكن تصفية عن طريق تحديد مساحة الحد الأدنى المقبول (الشكل 4).
يسمح تحليل تدفق الموصوفة هنا أنواع التقييم المباشر لالتصاق الكريات البيض إلى أحادي الطبقة المفوضية الأوروبية، توضيح التفاعل بين هذه الخلية اثنين، ولكن لا تأخذ في الاعتبار خلية أخرى أنواع, مثل بيريسيتيس التي موجودة في جدار الأوعية الدموية، وقد يكون أيضا المشاركة في تنظيم الكريات البيض التسرب15. يمكن تحسين إدماج المكروية ثقافة 3D مع أنواع الخلايا الأخرى أهمية الفسيولوجية للنظام. وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر تحليل تدفق لتقييم استجابات التحريضية الموصوفة هنا أداة قيمة لتوصيف الأساسية والمرض تطبيقات النمذجة ECs هيبسك.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن نعترف بالمنح التالية: “مجلس البحوث الأوروبي” (اركادج 323182 ستيمكارديوفاسك)؛ مبادرة الجهاز على رقاقة هولندا، مشروع “الجاذبية جمعية البحث العلمي الهولندية” بتمويل من وزارة التربية والتعليم والثقافة والعلوم من حكومة هولندا (024.003.001).
Materials
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
