Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

1. preparazione di soluzioni e reagenti Preparare completo supporto di Human Endothelial-SFM (CE-SFM pieno) con l’aggiunta di siero plasma-derivato della piastrina-poveri (1%), fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF, 20 ng/mL) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF, 50 ng/mL) a Human Endothelial-SFM (Vedi tabella di Materiali). Filtrare il mezzo attraverso un filtro da 0,22 µm a poro e conservarla a 4 ° C fino a 2 settimane. Preparare il terreno RPMI completo con l’aggiunta di siero bovino fetale (10%), 2-mercaptoetanolo (0,05 nM), L-Glutammina (1%), penicillina-streptomicina (25 U/mL) per medium RPMI (Vedi Tabella materiali). Conservare a 4 ° C fino a 3 settimane. 2. rivestimento di Microfluidic chip Inserire un biochip sterile in una capsula di Petri sterile 10cm. Preparare soluzione di lavoro di fibronectina mediante ricostituzione la soluzione di riserva in tampone fosfato salino (PBS) senza Ca2 +/Mg2 + a una concentrazione finale di 50 µ g/mL. Stima 80 µ l di soluzione di lavoro per biochip. Iniettare 10 µ l di soluzione di lavoro di fibronectina in ciascun canale del biochip. Utilizzare una pipetta con piccole punte di 10 µ l e assicurarsi che formare un contatto stretto tra l’imbocco del canale e la punta della pipetta (Figura 1, sinistra). Chiudere il coperchio del piatto Petri contenente il biochip e posizionarlo in una camera umidificata (Figura 2B). Conservare la camera a 4 ° C durante la notte. Umidificare la camera, mettere una velina pulita nella parte inferiore della camera umidificata e aggiungere 5 mL di sterile H2O. Giorno successivo, prima del saggio, pre-riscaldare il biochip a 37 ° C nell’incubatore. 3. preparazione del hiPSC-ECs Nota: Nel protocollo descritto qui, hiPSC-ECs erano differenziati, purificata, crioconservati e scongelato come descritto in precedenza8. Disgelo e piastra hiPSC-ECs in completa CE-SFM pieno in uno 0,1% rivestite con gelatina T75 matraccio, tre o quattro giorni prima del dosaggio. La notte prima del dosaggio, stimolare hiPSC-ECs con TNFα aggiungendo CE-SFM pieno addizionata di 10 ng/mL TNFα e incubare pernottamento (~ 12 h) a 37 ° C, come descritto in precedenza 7. 4. hiPSC-ECs dissociazione e il Seeding in Chip microfluidico Il giorno del test, è necessario prendere la fiaschetta di hiPSC-ECs dall’incubatrice ed esaminare le cellule sotto il microscopio. Assicurarsi che hiPSC-ECs sono 80 – 100% confluenti e hanno una morfologia tipica di CE-come. Trasferire il pallone nel cofano cultura cellulare. Aspirare il mezzo dal pallone di hiPSC-ECs. Lavare brevemente la coltura delle cellule con l’aggiunta di 10 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Aspirare il PBS. Aggiungere 4 mL per fiaschetta di enzima di dissociazione di 1x. Incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA) (Figura 1B). Fermare la reazione di dissociazione aggiungendo 8 mL di terreno di Human Endothelial-SFM per fiaschetta. Delicatamente staccare e raccogliere la hiPSC-ECs in sospensione in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta da 5 mL. Contare il numero totale delle cellule in sospensione. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 minuti a TA. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in CE-SFM pieno a una concentrazione finale di 1.5 x 107 cellule/mL. Togliere la capsula di Petri con il biochip dall’incubatrice e trasferirlo alla cappa di cultura cellulare. Aspirare la soluzione di fibronectina da tutti i canali del chip microfluidici. Iniettare 6 µ l di sospensione cellulare in ogni canale utilizzando una pipetta con una punta piccola e 10 µ l (Figura 1, medio). Assicurarsi che la sospensione cellulare viene mescolata bene prima dell’iniezione ed evitare la precipitazione di cella. Esaminare il biochip sotto il microscopio e assicurarsi che le celle sono distribuite uniformemente, e la densità cellulare è alta (Figura 2). Incubare il biochip per 15 min a 37 ° C. Aggiungere 40 µ l di CE-SFM pieno nei serbatoi medi da entrambi i lati di ogni canale. Incubare il biochip per 1h a 37 ° C (Figura 1, destra). Aggiungere un altro 50 µ l di CE-SFM pieno nei serbatoi da entrambi i lati di ogni canale. 5. preparazione dei leucociti umani Nota: Nel protocollo descritto qui, una linea cellulare monocytic commercialmente disponibile (THP-1) è stata utilizzata. In alternativa, possono essere utilizzati cellule mononucleari del sangue periferico o neutrofili. Isolamento dei monociti del sangue periferico e dei neutrofili può essere eseguita utilizzando la procedura standard11. Eseguire tutti i passaggi descritti in questo paragrafo in una cappa di cultura cellulare. Raccogliere i leucociti in una provetta conica da 50 mL. Lavare i leucociti con 10 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min a RT (Figura 1). Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS con tintura DiOC6 (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Incubare le cellule al buio per 10 minuti a TA. Lavare i leucociti con 10 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min a RT. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. Contare il numero totale delle cellule in sospensione. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in terreno RPMI completo a una concentrazione finale di 2,5 x 106 cellule/mL. 6. preparazione della pompa microfluidica Montare la pompa di microfluidica con il collettore di 8 canali. Collegare la pompa ad un PC con il software di gestione installato. Avviare il software di microfluidica e caricare il protocollo cliccando Open Protocol e navigare sul PC per selezionare il protocollo di microfluidica. Collegare la pompa e il software selezionando la cartella di installazione e facendo clic su Esegui analisi passo. Per definire la geometria dei canali per il controllo della corretta portata: selezionare la Geometria di aggiornamento nella cartella di Installazione di geometria e fare clic su Esegui analisi passo.Nota: Assicurarsi che i dettagli di geometria corrispondano la siringa e canali da utilizzare (geometria ID = 1, numero di canali = 8, larghezza del canale = 800.0 µm, profondità del canale = 120.0 µm, volume della siringa = 250 µ l) e la viscosità del campione (viscosità del liquido = 1.0). Lavare la pompa inserendo il cavo di ingresso (arancione) nella provetta conica 50 mL contenente etanolo di 80%. Posizionare il cavo di uscita (verde) nel tubo vuoto conica 50 mL (contenitore per rifiuti). Selezionare la cartella di Washout di Washout/pompa e fare clic su Esegui analisi passo (lavare volume = 2000 µ l, passaggio di volume di lavaggio = 250 µ l, direzione di Washout = Output). Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio. Ripetere la pompa lavaggio passaggi (6.6-6.7) con acqua di grado di coltura delle cellule e terreno di coltura umana Endothelial-SFM. Continuare con la fase di lavaggio del collettore. Aprire manualmente la valvola tra la siringa e il collettore inserendo l’adattatore 3VIE nella posizione corretta (indicatore OFF è girata a sinistra). Selezionare Set Current Channel/Apri passo nella cartella Colori attenuati con collettore Wash e fare clic su Esegui analisi passo per aprire tutte le valvole del gruppo manometrico. Lavare il collettore manualmente premendo 5 mL di etanolo 80% dalla siringa, seguita da 5 mL di acqua di grado di cultura cellulare. Lavare il collettore premendo 5 mL di terreno di coltura umana Endothelial-SFM dalla siringa. Rimuovere tutte le bolle di aria di grandi dimensioni che sono intrappolate nel collettore. Per effettuare questa operazione, inserire l’adattatore di pin di 8 pozzetti i 10 cm di Petri con il mezzo ed eseguire spingere/tirare con la siringa fino a quando tutte le bolle d’aria grandi sono andate (piccole bolle non sono un problema). Selezionare Set Current Channel/chiusura passaggio nella cartella Colori attenuati con collettore Wash e fare clic su Esegui analisi passo per chiudere tutte le valvole del gruppo manometrico. Collegare il cavo di uscita verde dalla pompa alla scheda di collettore. La valvola a 3 vie tornare sulla posizione OFF per chiudere la siringa. Selezionare cartella di Washout di Washout (via cavo) e fare clic su Eseguire analisi passo per lavare ogni porta con medium RPMI individualmente, assicurando che tutte le bolle vengono rimossi da ogni cavo (erogazione volume = 100 µ l).Nota: Ogni valvola del collettore è aperto uno-ad-uno, mentre gli altri canali chiusi, 1 a 8 e 100 μL del mezzo viene erogata attraverso ogni singolo canale. Assicurarsi che il liquido viene eseguito da ogni pin. Se non c’è nessun liquido che esce, è un’indicazione di una bolla d’aria o uno zoccolo. 7. preparazione del Chip microfluidici per Live Imaging Assicurarsi che le configurazioni di microfluidica sono pronte e la camera dal vivo di formazione immagine è pre-equilibrata a 37 ° C e il livello di CO2 raggiunge il 5% (Figura 3A, B). Prendere il biochip dall’incubatrice e posizionarlo sul supporto di chip di microscopio. Montare il supporto di chip sul microscopio imaging fase (Figura 3). Al fine di collegare il biochip alla pompa tramite il collettore, posizionare l’adattatore 8 pin vicino i bacini di uscita del chip e approfondire tutti i perni nel medium (ma non collegare completamente). Selezionare l’interruzione di | Connettersi a Chip cartella e fare clic su Esegui analisi passo per erogare medium RPMI prima di collegare il chip (erogazione volume = 30 mL). Una volta che il mezzo viene erogato, inserire l’adattatore 8 pin nella presa del biochip.Nota: Durante questo passaggio, tutti i canali sono impostati su (Apri) e 30 µ l del mezzo viene erogata attraverso ogni canale e a seguire i canali sono impostati su Off (chiuso). Questo garantisce che nessun aria bolle saranno introdotti nei canali del chip microfluidici. Manualmente e aspirare il mezzo da tutti i serbatoi di ingresso del biochip con una pipetta. Selezionare l’interruzione di | Washout di chip cartella e fare clic su Esegui analisi passo per irrorare 40 mL di mezzo di CE-SFM pieno attraverso ognuno dei canali-uno per sbarazzarsi dei morti cellule/detriti dal canale (volume di Washout = 40 µ l, taglio di washout di massimo = 40 dynes/cm2). 8. flusso di analisi di adesione e acquisizione immagini Manualmente e aspirare il mezzo dal bacino dell’ingresso del canale di interesse con una pipetta. Aggiungere 100 µ l di leucociti da passo 5.6 al serbatoio di ingresso del canale di interesse.Nota: Mescolare delicatamente le cellule per fare una sospensione unicellulare. Nell’analisi della cella | Passaggio Descrizione cartella, selezionare Descrizione Set Current Channel/passo e, nell’elenco dei canali, selezionare solo il canale corrente di interesse e impostato su On (aperta) e impostare tutti gli altri sette canali Off (chiuso). Selezionare l’analisi delle cellule di | Passaggio Descrizione cartella e fare clic su Esegui analisi passo.Nota: Assicurarsi che l’Erogazione di tasso di flusso variabile applicata costante pressione negativa per tirare la sospensione del leucocita del serbatoio di aspirazione attraverso il canale per 5 min (insieme di taglio = costante, Shear stress =-0,50 dyne/cm2, durata = 00:05:00, Ritardo Scan = 00:00:00). Il valore negativo di sollecitazione di taglio garantisce la corretta direzione del flusso. Aspirare i leucociti rimanenti dal bacino dell’ingresso. Aggiungere 100 µ l di terreno RPMI completo il serbatoio di aspirazione. Selezionare cella analisi/passo Descrizione cartella e fare clic su Eseguire analisi passo per irrorare il canale per 5 min con medium RPMI al fine di lavare tutti i leucociti non aderenti (insieme di taglio = costante, Shear stress =-0,50 dyne/cm2, durata = 00:05 00, ritardo di scansione = 00:00:00). Acquisire immagini da almeno tre o quattro diverse posizioni del canale all’immagine i leucociti aderiti (per assicurare che sono acquisite in aree rappresentative). Ripetere i passaggi da 8.1 – 8,7 per la valutazione funzionale di tutto il resto dei canali.Nota: È possibile eseguire contemporaneamente più canali. A tale scopo, aprire tutti i canali di interesse durante il passaggio 8.3. ed eseguire tutti i suddetti passaggi 8.4 –8.7 per più canali di interesse. 9. completare il test e pulizia della pompa di microfluidica Dopo aver completato l’esperimento, esportare e salvare tutte le immagini in formato RAW. Risparmiando i risultati, eseguire la pompa di microfluidica e il collettore di protocollo di pulizia. Per la pompa di microfluidica, eseguire prima la cartella di Washout/pompa Washout irrorando 4 mL di acqua di grado di cultura cellulare, seguita da 4 mL di 80% etanolo come descritto nei passaggi 6.6 – 6.7 a secco la pompa facendo girare l’aria per alcuni minuti. Al fine di pulire il collettore, è necessario eseguire il passaggio di Washout/collettore Wash con la siringa. La procedura per aprire la siringa e le valvole del collettore come descritto nella procedura 6.10 – 6,11 lavata prima con 80% di etanolo e successivo con acqua di grado di cultura cellulare. Asciugare il collettore spingendo l’aria tramite la siringa. Chiudere la valvola di siringa e le valvole del collettore come descritto nella procedura 6.10 e 6.15. 10. conteggio dei leucociti aderenti Scaricare e installare software14 dal http://cellprofiler.org di elaborazione delle immagini.Nota: Immagine di elaborazione in questo studio è stato effettuato utilizzando il software versione 2.1.1. Se si utilizza una versione più recente, la pipeline potrebbe richiedere minor adattamento. Scarica la pipeline Count_leukocytes.cpipe. Fare clic su File | Importazione | Pipeline di dal file e navigare sul PC per scegliere la pipeline Count_leukocytes.cpipe. Drag-and-drop una cartella con immagini RAW acquisite dei leucociti aderenti alla finestra elenco File nei moduli Input | Immagini sezione per l’analisi. Specificare le dimensioni tipiche dei leucociti via analisi moduli | IdentifyPrimaryObjects. Specificare il diametro minimo e massimo dei leucociti aderenti in pixel. Selezionare i criteri di filtro tramite moduli analisi | FilterObjects. Specificare l’area come minimo accettato di oggetti in pixel. Avviare l’analisi premendo sul pulsante Analyze images .Nota: Tutte le immagini RAW saranno trasformate, e i risultati verranno salvati in una cartella di destinazione predefinita. Il file di output Image.txt contiene i numeri dei leucociti aderenti in ogni immagine elaborata (ogni numero corrisponde ad una sola immagine, cioè, ogni campo di vista acquistata).