Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

1. préparation des Solutions et réactifs Préparer, milieu humain endothéliales-GDF complet (FULL EC-GDF) en ajoutant sérum de dérivés du plasma pauvre en plaquettes (1 %), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF, 20 ng/mL) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF, 50 ng/mL) pour homme endothéliales-GDF (voir Table de Matériaux). Le support de filtration à travers un filtre de porosité de 0,22 µm et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. Préparer le milieu RPMI complet en ajoutant le sérum de veau fœtal (10 %), 2-mercaptoéthanol (0,05 nM), L-glutamine (1 %), la pénicilline-streptomycine (25 U/mL) au milieu RPMI (voir Table des matières). Conserver à 4 ° C pendant 3 semaines. 2. revêtement de microfluidique puces Placez une biopuce stérile dans une boîte de Petri stérile de 10 cm. Préparer la solution de travail la fibronectine par reconstitution de la solution mère dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2 +/Mg2 + à une concentration finale de 50 µg/mL. Estimer les 80 µL de solution de travail par biopuces. Injecter 10 µL de solution de travail de la fibronectine dans chacun des canaux de la biopuce. Utiliser une pipette avec petit 10 conseils µL et assurez-vous que former un contact étroit entre l’entrée du canal et l’embout de la pipette (Figure 1, à gauche). Fermer le couvercle de la boîte de Pétri contenant la biopuce et placez-le dans une chambre humidifiée (Figure 2 b). Ranger la chambre à 4 ° C durant la nuit. Pour humidifier la chambre, placer un papier tissu propre au fond de la chambre humidifiée et ajouter 5 mL de stérile H2O. Lendemain, avant le dosage, réchauffez la biopuce à 37 ° C dans l’incubateur. 3. préparation d’ECs-hiPSC Remarque : Dans le protocole décrit ici, hiPSC-ECs étaient dissociés, purifiés, cryopréservés et décongelés comme décrit précédemment8. Dégel et plaque hiPSC-ECs en EC-GDF complet complet dans un seul 0,1 % enduit de gélatine T75 fiole, trois ou quatre jours avant le test. La nuit précédant le dosage, stimuler hiPSC-ECs avec TNFα en ajoutant EC-GDF plein additionné de 10 ng/mL TNFα et incuber pendant la nuit (~ 12 h) à 37 ° C, comme décrit précédemment 7. 4. hiPSC-ECs Dissociation et ensemencement en puce microfluidique Le jour du test, prendre le ballon d’ECs-hiPSC de l’incubateur et d’examiner les cellules au microscope. Veiller à ce que hiPSC-ECs sont confluents de 80 à 100 % et ont une morphologie typique EC. Transvaser le ballon dans la hotte de la culture cellulaire. Aspirez le milieu de la fiole d’hiPSC-ECs. Lavez brièvement la culture cellulaire en ajoutant 10 mL de PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Aspirer le PBS. Ajouter 4 mL par flacon d’enzyme de dissociation 1 x. Incuber 5 min à température ambiante (RT) (Figure 1 b). Arrêter la réaction de dissociation en ajoutant 8 mL de milieu humain endothéliales-GDF par flacon. Doucement, détacher et recueillir la suspension hiPSC-ECs dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL. Compter le nombre total des cellules de la suspension. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans EC-GDF complet à une concentration finale de 1. 5 x 107 cellules/mL. Sortez de la boîte de Pétri avec les biopuces de l’incubateur et le transférer à la hotte de la culture cellulaire. Aspirer la solution de la fibronectine de tous les canaux de la puce microfluidique. Injecter 6 µL de la suspension cellulaire dans chaque canal à l’aide d’une pipette avec une pointe de petit 10 µL (Figure 1, milieu). Assurez-vous que la suspension cellulaire est mélangée bien avant l’injection et éviter la précipitation de la cellule. Examiner la biopuce sous le microscope et faire en sorte que les cellules sont réparties uniformément, et la densité cellulaire est élevée (Figure 2). Incuber les biopuces pendant 15 min à 37 ° C. Ajouter 40 µL d’EC-GDF complet dans les réservoirs moyens des deux côtés de chaque canal. Incuber les biopuces pendant 1 h à 37 ° C (Figure 1, droit). Ajouter un autre à 50 µL de EC-GDF complet dans les réservoirs des deux côtés de chaque canal. 5. préparation des leucocytes humains Remarque : Dans le protocole décrit ici, une lignée monocytaire commercialement disponibles (THP-1) a été utilisée. Par ailleurs, les cellules mononucléaires de sang périphérique ou neutrophiles peuvent être utilisés. Isolement des monocytes du sang périphérique et les neutrophiles peut être effectuée à l’aide de la procédure standard11. Exécutez toutes les étapes décrites dans ce paragraphe sous une hotte de culture cellulaire. Recueillir les leucocytes dans un tube conique de 50 mL. Laver les leucocytes avec 10 mL de PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min à ta (Figure 1). Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS avec colorant DiOC6 (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5 000). Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 10 min à température ambiante. Laver les leucocytes avec 10 mL de PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min à RT. répéter l’étape de lavage une fois de plus. Compter le nombre total des cellules de la suspension. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans milieu RPMI complet à une concentration finale de 2. 5 x 106 cellules/mL. 6. préparation de la pompe de microfluidique Assembler la pompe microfluidique avec le collecteur de 8 canaux. Connecter la pompe à un PC avec le logiciel d’exploitation installé. Lancez le logiciel de la microfluidique et charger le protocole en cliquant sur le Protocole ouvert et naviguer sur le PC pour sélectionner le protocole de la microfluidique. Branchez la pompe et le logiciel en sélectionnant le dossier d’installation en cliquant sur Exécuter test étape. Définir la géométrie des canaux pour la commande de taux de débit correct : sélectionnez la Géométrie de mise à jour dans le dossier Setup de géométrie , puis cliquez sur Exécuter test étape.Remarque : Assurez-vous que les détails de la géométrie correspondent à la seringue et les canaux à utiliser (géométrie ID = 1, nombre de canaux = 8, largeur du chenal = 800,0 µm, profondeur du chenal = 120.0 µm, volume de la seringue = 250 µL) et la viscosité de l’échantillon (viscosité liquide = 1,0). Laver la pompe en mettant le câble d’entrée (orange) dans le tube conique de 50 mL contenant 80 % d’éthanol. Placer le câble de sortie (vert) dans le tube à vide conique 50 mL (poubelle). Sélectionnez le dossier de Lavage de lavage/pompe , puis cliquez sur Exécuter test étape (lavage volume = 2000 µL, pas de volume de lavage = 250 µL, direction lavage = sortie). Répétez l’étape de lavage une fois de plus. Répétez la pompe lavage des marches (6,6 – 6,7) avec l’eau de qualité de culture cellulaire et milieu de culture humaine endothéliales-GDF. Passez à l’étape de lavage de la tubulure d’admission. Ouvrir manuellement la valve entre la seringue et le collecteur en plaçant l’adaptateur 3-way dans la position correcte (indicateur OFF est tourné vers la gauche). Sélectionnez Régler les chaînes de courant/Open étape dans le dossier de Lavage lavage/collecteur , puis cliquez sur Exécuter test étape pour ouvrir toutes les vannes du collecteur. Laver le collecteur manuellement en appuyant sur 5 mL d’éthanol à 80 % de la seringue, suivie par 5 mL d’eau de qualité de culture cellulaire. Laver le collecteur en appuyant 5 mL de milieu de culture humaine endothéliales-GDF de la seringue. Enlever toutes les bulles d’air important qui sont piégés dans le collecteur. Pour ce faire, placez l’adaptateur de broche 8 puits dans les 10 cm boîte de Pétri avec le milieu et accomplir en poussant/tirant avec la seringue jusqu’à ce que toutes les bulles d’air important ont disparu (petites bulles ne sont pas un problème). Sélectionnez Régler les chaînes de courant/fermer étape dans le dossier de Lavage lavage/collecteur , puis cliquez sur Exécuter test étape pour fermer tous les robinets du manifold. Connectez le câble de sortie verte de la pompe à l’adaptateur de collecteur. Mettre la vanne 3 voies sur la position OFF pour fermer la seringue. Sélectionnez dossier Lavage lavage/câble , puis cliquez sur Exécuter test étape pour laver chaque port avec milieu RPMI individuellement, veiller à ce que toutes les bulles sont retirés de chaque câble (volume de distribution = 100 µL).Remarque : Chaque vanne du collecteur est ouvert un par un, de 1 à 8 et 100 μL du milieu est distribué par l’intermédiaire de chaque canal individuellement tout en gardant les autres chaînes fermées. Veillez à ce que le liquide s’étend de chaque broche. S’il n’y a pas de liquide qui sort, c’est une indication d’une bulle d’air ou un sabot. 7. préparation de la puce microfluidique pour vivre d’imagerie S’assurer que les configurations de microfluidique sont prêtes et la chambre d’imagerie live est préalablement équilibrée à 37 ° C et le taux de CO2 atteint 5 % (Figure 3 a, B). Prenons les biopuces de l’incubateur et placez-la dans le support de puce de microscope. Fixer le support de la puce sur le microscope imaging stade (Figure 3). Afin de connecter la biopuce via le collecteur à la pompe, placer l’adaptateur 8 broches près des réservoirs de la sortie de la puce et approfondir toutes les broches dans le milieu (mais ne branchez pas complètement). Sélectionnez le lavage de | Se connecter à puce dossier, puis cliquez sur Exécuter test étape pour distribuer le milieu RPMI avant de connecter la puce (volume de distribution = 30 mL). Une fois que le milieu est dispensé, insérez l’adaptateur 8 broches dans la prise de la biopuce.Remarque : Au cours de cette étape, tous les canaux sont en position sur (ouvrir) et 30 µL du milieu est distribué par l’intermédiaire de chaque canal et suite à cela, les canaux sont définies sur Off (fermé). De cette manière, pas d’air bulles seront introduits dans les canaux de la puce microfluidique. Manuellement aspirer le support de tous les réservoirs d’arrivée de la biopuce avec une pipette. Sélectionnez le lavage de | Puce de lavage dossier, puis cliquez sur Exécuter test étape à perfuse 40 mL de milieu EC-GDF complet à travers les canaux un par un pour se débarrasser des cellules mortes/débris du canal (volume de lavage = 40 µL, cisaillement de lavage Maximum = 40 dynes/cm2). 8. flow adhérence Assay et Acquisition d’images Manuellement aspirer le support du réservoir d’entrée du chenal d’intérêt avec une pipette. Ajouter 100 µL de leucocytes de 5,6 étape vers le réservoir de l’entrée du chenal d’intérêt.Remarque : Mélanger délicatement les cellules pour produire une suspension de cellules individuelles. Dans l’analyse de cellules | Description de l’étape dossier, sélectionnez Set Current Channel/Step Description , dans la liste des canaux, sélectionnez uniquement le canal courant d’intérêt et en position On (ouvert) valeur et tous les autres sept canaux Off (fermé). Sélectionnez le test de cellule | Description de l’étape dossier, puis cliquez sur Exécuter test étape.Remarque : Assurez-vous que Taux de débit Variable distribution s’applique une pression négative constante pour tirer la suspension de leucocytes provenant du réservoir d’entrée via le canal pendant 5 min (ensemble de cisaillement = constante, contrainte de cisaillement =-0,50 dyne/cm2, durée = 00:05:00, Scan de retard = 00:00:00). La valeur négative de la contrainte de cisaillement assure le bon sens de l’écoulement. Aspirer les leucocytes restants dans le réservoir d’aspiration. Ajouter 100 µL de milieu RPMI complet au réservoir d’aspiration. Sélectionnez dossier cellule test/Step description , puis cliquez sur Exécuter test étape pour perfuse le canal pendant 5 min avec milieu RPMI afin d’estomper tous les leucocytes non adhérents (ensemble de cisaillement = constante, contrainte de cisaillement =-0,50 dyne/cm2, durée = 00 : 05:00, retard de Scan = 00:00:00). Acquérir des images d’au moins trois ou quatre positions différentes du chenal afin d’imager les leucocytes adhérés (pour s’assurer que les aires représentatives sont capturées). Répétez les étapes 8.1 – 8,7 pour évaluation fonctionnelle de l’ensemble des canaux.Remarque : Il est possible d’exécuter plusieurs canaux à la fois. Pour ce faire, ouvrir tous les canaux d’intérêt au cours de l’étape de 8.3. et effectuer tous les précités étapes 8,4 –8.7 pour plusieurs canaux d’intérêt. 9. Comment remplir le test et le nettoyage de la pompe de la microfluidique À l’issue de l’expérience, exporter et enregistrer toutes les images au format RAW. Lors de l’enregistrement des résultats, exécutez la pompe de la microfluidique et le collecteur protocole de nettoyage. Pour la pompe de la microfluidique, exécutez d’abord le dossier de Lavage/pompe lavage en perfusant 4 mL d’eau de qualité de culture cellulaire, puis 4 mL 80 % éthanol comme décrit aux étapes 6.6 – 6,7 sec la pompe en exécutant l’air pendant plusieurs minutes. Afin de nettoyer le collecteur, exécutez pas de Lavage de lavage/collecteur avec la seringue. Suivez les étapes pour ouvrir la seringue et les valves multiples tel que décrit dans les étapes 6.10 – 6.11 lavage tout d’abord avec l’éthanol à 80 % et prochaine avec l’eau de qualité de culture cellulaire. Sécher le collecteur en poussant l’air par l’intermédiaire de la seringue. Fermer la vanne de la seringue et les valves multiples comme décrit aux étapes 6.10 et 6.15. 10. décompte des leucocytes adhérentes Téléchargez et installez le logiciel14 de http://cellprofiler.org de traitement d’image.Remarque : Traitement dans cette étude de l’image a été réalisée à l’aide du logiciel version 2.1.1. Si vous utilisez une version plus récente, le pipeline peut nécessiter une adaptation mineure. Télécharger le pipeline Count_leukocytes.cpipe. Cliquez sur le fichier | Importation | Pipeline partir du fichier et naviguer sur PC pour choisir le pipeline Count_leukocytes.cpipe. Glisser-déposer un dossier avec les images RAW acquis des leucocytes adhérentes à la fenêtre de liste de fichiers dans les modules de entrée | Images section pour analyse. Spécifier la taille typique des leucocytes via des modules analyse | IdentifyPrimaryObjects. Spécifiez le diamètre minimal et maximal des leucocytes adhérentes en pixels. Sélectionnez les critères de filtrage via des modules analyse | FilterObjects. Indiquez la surface minimale acceptée d’objets en pixels. Démarrer l’analyse en appuyant sur le bouton Analyze images .Remarque : Toutes les images RAW seront traitées et les résultats seront enregistrées dans un dossier de sortie par défaut. Le fichier de sortie Image.txt contient le nombre de leucocytes adhérentes dans chaque image traitée (chaque numéro correspond à une image, c’est-à-dire, chaque champ de vue acquis).