Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen Bereiten Sie komplette menschliche Endothelial-SFM-Medium (EG-SFM voll) durch Zugabe von Thrombozyten-Armen Plasma gewonnenen Serum (1 %), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 20 ng/mL) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, 50 ng/mL), Human Endothelial-SFM (siehe Tabelle des Materialien). Filtern Sie das Medium durch einen 0,22 µm-Poren-Filter und speichern sie bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. Bereiten Sie komplette RPMI Medium durch Zugabe von fetalen Rinderserum (10 %), 2-Mercaptoethanol (0,05 nM), L-Glutamin (1 %), Penicillin-Streptomycin (25 U/mL) auf RPMI Medium (siehe Tabelle der Materialien). Für bis zu 3 Wochen bei 4 ° C lagern. 2. Beschichtung von mikrofluidischen Chips Legen Sie einen sterilen Biochip in eine sterile Petrischale 10 cm. Bereiten Sie Fibronektin Arbeitslösung durch Neuaufbau der Stammlösung in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 +/Mg2 + , eine Endkonzentration von 50 µg/mL. Schätzen Sie 80 µL Arbeitslösung pro Biochip. Injizieren Sie 10 µL Arbeitslösung Fibronektin in jedem Kanal des Biochips. Verwenden Sie eine Pipette mit kleinen 10 µL Tipps und stellen Sie sicher, einen engen Kontakt zwischen dem Kanal Zulauf und die Pipettenspitze (Abbildung 1, links) bilden. Schließen Sie den Deckel der Petrischale mit Biochips und legen Sie sie in eine feuchte Kammer (Abbildung 2 b). Speichern Sie die Kammer bei 4 ° C über Nacht. Um die Kammer zu befeuchten, platzieren Sie einem sauberen Papiertuch zu, an der Unterseite der feuchte Kammer und 5 mL sterile H2O. Nächsten Tag, bevor der Test Vorwärmen der Biochip bei 37 ° C im Brutschrank. 3. Vorbereitung des HiPSC-ECs Hinweis: In dem hier beschriebenen Protokoll wurden HiPSC-ECs differenziert, gereinigt, kryokonserviert und wie zuvor beschrieben8aufgetaut. Tauwetter und Platte HiPSC-ECs in vollständige EG-SFM voll in eine 0,1 % Gelatine beschichtet T75 Kolben, drei bis vier Tage vor dem Test. Die Nacht vor der Assay stimulieren HiPSC-ECs mit TNF durch Zugabe von EG-SFM voll mit 10 ng/mL TNF ergänzt und inkubieren Sie über Nacht (12 h) bei 37 ° C, wie zuvor beschrieben 7. 4. HiPSC-ECs Dissoziation und Aussaat in mikrofluidischen Chip Am Tag des Tests den Kolben des HiPSC-ECs aus dem Inkubator nehmen und die Zellen unter dem Mikroskop zu untersuchen. Sicherzustellen Sie, dass HiPSC-ECs 80 – 100 % Zusammenfluss und eine typische EG-ähnliche Morphologie haben. Übertragen Sie den Kolben in die Zelle-Kultur-Haube. Aspirieren Sie das Medium aus der Flasche des HiPSC-ECs. Kurz waschen der Zellkultur durch Zugabe von 10 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Aspirieren Sie die PBS. 4 mL pro Flasche 1 X Dissoziation Enzym hinzugeben. 5 min bei Raumtemperatur (RT) (Abbildung 1 b) inkubieren. Stoppen Sie die Dissoziation Reaktion durch Zugabe von 8 mL Human Endothelial-SFM Medium pro Flasche. Sanft lösen Sie und sammeln Sie die HiPSC-ECs-Suspension in einem 15 mL konische Röhrchen mit einer 5 mL-Pipette. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 3 min bei RT Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in vollständige EG-SFM, eine Endkonzentration von 1,5 x 107 Zellen/mL. Nehmen Sie die Petrischale mit Biochips aus dem Inkubator und überträgt es auf die Zelle-Kultur-Haube. Aspirieren der Fibronektin-Lösung aus allen Kanälen der Mikrofluidik-Chip. Injizieren Sie 6 µL Zellsuspension in jeden Kanal mit einer Pipette mit einer kleinen 10 µL-Spitze (Abbildung 1, Mitte). Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension vor der Injektion gut durchmischt ist und vermeiden Sie Zelle Niederschlag. Der Biochip unter dem Mikroskop zu untersuchen und dafür sorgen, dass die Zellen sind gleichmäßig verteilt, und die Zelldichte hoch ist (Abbildung 2). Inkubieren Sie Biochips für 15 min bei 37 ° c 40 µL des EG-SFM voll in die mittlere Behälter von beiden Seiten der einzelnen Kanäle hinzufügen. Inkubieren Sie Biochips für 1 h bei 37 ° C (Abbildung 1, rechts). Fügen Sie ein weiteres 50 µL vollständige EG-SFM in den Stauseen von beiden Seiten des Kanals. 5. Vorbereitung des menschlichen Leukozyten Hinweis: In dem hier beschriebenen Protokoll wurde eine handelsübliche monozytären Zelllinie (THP-1) verwendet. Alternativ können die peripheren mononukleären Blutzellen oder Neutrophilen verwendet werden. Isolierung von peripherem Blut Monozyten und Neutrophile kann mit Standardverfahren11durchgeführt werden. Durchführen Sie alle in diesem Absatz in einer Zelle Kultur Kapuze beschriebenen Schritte. Sammeln Sie die Leukozyten in einem 50 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Leukozyten mit 10 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 3 min bei RT (Abbildung 1). Den Überstand abgesaugt und erneut die Zelle Pellet in 1 mL PBS mit DiOC6 Farbstoff (λex = 485 nm, λEm = 501 nm) (1:5 000). Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 10 min bei RT Waschen Sie die Leukozyten mit 10 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 3 min bei RT. Wiederholung der Reinigung Schritt noch einmal. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in kompletten RPMI Medium, eine Endkonzentration von 2,5 x 106 Zellen/mL. 6. Vorbereitung der mikrofluidischen Pumpe Montieren Sie die mikrofluidischen Pumpe mit dem 8-Kanal-Verteiler. Schließen Sie die Pumpe an einen PC mit dem installierten Betriebssoftware. Starten Sie die Software von mikrofluidischen und laden Sie das Protokoll, indem Offene Protokoll und Navigieren auf dem PC das mikrofluidischen Protokoll auswählen. Schließen Sie die Software und die Pumpe durch den Setup -Ordner auswählen und auf Run Test Schritt. Definieren Sie die Geometrie der Kanäle für den richtigen Fluss Tarifsteuerung: Wählen Sie Update Geometrie in der Geometrie Setup -Ordner und klicken Sie auf Run Test Schritt.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Geometrie Details die Spritze und Kanäle verwendet werden (Geometrie-ID = 1, Anzahl der Kanäle = 8, Kanalbreite = 800,0 µm, Kanaltiefe = 120.0 µm, Spritzenvolumen = 250 µL) und die Viskosität der Probe (Viskosität der Flüssigkeit = 1,0). Waschen Sie die Pumpe durch die Platzierung der Anschlussleitung (Orange) in der 50 mL konische Röhrchen mit 80 % igem Ethanol. Legen Sie die Steckdose Kabel (grün) in 50 mL konische Leerrohr (Abfallbehälter). Wählen Sie den Auswaschung/Pumpe Washout -Ordner und klicken Sie auf Ausführen Assay Schritt (Waschen Volumen = 2000 µL, Volumen Waschschritt = 250 µL, Washout Richtung = Ausgang). Wiederholen Sie waschen noch einmal. Wiederholen Sie die Pumpe waschen Schritte (6,6-6,7) mit Kultur Grade Zellwasser und menschlichen Endothelial-SFM Kulturmedium. Fahren Sie mit der Reinigung Schritt des Verteilers. Öffnen Sie das Ventil zwischen der Spritze und die vielfältigen manuell indem man die 3-Wege-Adapter in die richtige Position (Kennzeichen, die auf der linken Seite deaktiviert ist ). Wählen Sie Set Current Channel/offene Schritt im Ordner ” Auswaschung/Verteiler Wash ” und klicken Sie auf Ausführen Assay Schritt um alle Ventile des Verteilers zu öffnen. Waschen Sie die vielfältigen manuell durch Drücken 5 mL 80 % Ethanol aus der Spritze, gefolgt von 5 mL Kultur Grade Zellwasser. Waschen Sie die vielfältigen 5 mL Kulturmedium Human Endothelial-SFM aus der Spritze drücken. Entfernen Sie alle großen Luftblasen eingeschlossen sind im Verteiler. Um dies zu tun, 8-Brunnen-Pin-Adapter in die 10 cm Petrischale mit dem Medium zu platzieren und mit der Spritze durchführen schieben/ziehen, bis alle großen Luftblasen verschwunden sind (kleine Bläschen sind kein Problem). Wählen Sie Set Current Channel/Close Schritt im Ordner ” Auswaschung/Verteiler Wash ” und klicken Sie auf Run Assay Schritt um alle Ventile der Monteurhilfe schließen. Das grüne Steckdose Kabel von der Pumpe an den vielfältigen Adapter anschließen. Wechseln Sie das 3-Wege-Ventil wieder auf OFF stellen um die Spritze zu schließen. Auswaschung/Kabel Washout Ordner auswählen und klicken Sie auf Run Assay Schritt um jeden Port mit RPMI Medium einzeln zu waschen um sicherzustellen, dass jedes Kabel alle Luftblasen entfernt sind (verzichten Volumen = 100 µL).Hinweis: Jedes Ventil des Verteilers ist eröffnet-by-One, 1 bis 8 und 100 μL des Mediums wird durch jedes einzelnen Kanals verzichtet, während die anderen Kanäle zu halten geschlossen. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit aus jeder Stift läuft. Wenn es keine Flüssigkeit herauskommt gibt, ist es ein Hinweis auf eine Luftblase oder eine Verstopfung. 7. Vorbereitung der Mikrofluidik-Chip für Live-Imaging Sicherzustellen Sie, dass die mikrofluidischen Setups bereit sind, und die live Image Kammer Pre äquilibriert auf 37 ° C und das Niveau von CO2 5 % (Abbildung 3A, B erreicht). Nehmen Sie Biochips aus dem Inkubator und positionieren Sie es in das Mikroskop-Chip-Halter. Befestigen Sie die Chip-Halterung auf dem Mikroskop imaging-Phase (Abbildung 3). Um die Pumpe über den Verteiler der Biochip verbinden, legen Sie die 8-Pin-Adapter in der Nähe der Steckdose Stauseen des Chips und vertiefen Sie alle Pins im Medium (aber nicht schließen Sie ganz an). Wählen Sie die auswaschen | Verbinden Sie mit Chip Ordner und klicken Sie auf Run Test Schritt RPMI Medium vor dem Anschluss des Chips zu verzichten (Volumen verzichten = 30 mL). Sobald das Medium abgegeben wird, legen Sie die 8-Pin-Adapter in die Steckdose des Biochips.Hinweis: Bei diesem Schritt alle Kanäle werden sich voraussichtlich auf (offen) und 30 µL des Mediums wird durch jeden Kanal ausgegeben und im Anschluss daran werden die Kanäle auf Off (geschlossen) festgelegt. Dies sorgt dafür, dass keine Luft, die Bläschen in die Kanäle der Mikrofluidik-Chip eingeführt werden. Aspirieren Sie manuell das Medium von allen Einlass Stauseen des Biochips mit einer Pipette. Wählen Sie die auswaschen | Chip-Auswaschung Ordner und klicken Sie auf Run Assay Schritt zu 40 mL vollständige EG-SFM Medium durch jeden der Kanäle nacheinander get rid of die toten Zellen/Trümmer aus dem Kanal perfundieren (Washout Volumen = 40 µL, Maximum Auswaschung Scherung = 40 Dynes/cm2). (8) Flow Adhäsion Assay und Image-Übernahme Aspirieren Sie manuell das Medium aus dem Zulauf Reservoir des Kanals mit einer Pipette. Fügen Sie 100 µL Leukozyten aus Schritt 5.6 am Einlass Reservoir des Kanals von Interesse.Hinweis: Vorsichtig mischen der Zellen, um eine einzelne Zelle Aussetzung zu machen. In der Zelle Test | Schritt Beschreibung Ordner, wählen Sie Set Current Channel/Schritt Beschreibung und wählen Sie in der Liste der Kanäle, nur den aktuelle Kanal von Interesse und auf (offen) und alle anderen sieben Kanäle Off (geschlossen). Wählen Sie die -Zelle-Assay | Schritt Beschreibung Ordner und klicken Sie auf Run Test Schritt.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Variable Flow Rate Abgabe gilt konstanten Unterdruck die Leukozyten-Suspension aus dem Reservoir der Einlass durch den Kanal für 5 min ziehen (Scheren Set = konstante Schubspannung =-0,50 dyn/cm2, Dauer = 00:05:00 Scan-Verzögerung = 00:00:00). Der negative Wert der Schubspannung sorgt für die richtige Richtung der Strömung. Die restlichen Leukozyten aus dem Einlauf-Behälter abzusaugen. Die Einlass-Reservoir 100 µL kompletten RPMI Medium hinzufügen. Wählen Sie Zelle Assay/Schritt Beschreibung Ordner und klicken Sie auf Run Assay Schritt , um den Kanal für 5 min mit RPMI Medium durchspülen, um alle nicht-anhaftende Leukozyten auszuwaschen (Scheren Set = konstante Schubspannung =-0,50 dyn/cm2, Dauer = 00: 05:00, Scan Delay = 00:00:00). Abrufen von Bildern aus mindestens drei bis vier verschiedenen Positionen des Kanals zum Bild der eingehalten Leukozyten (um sicherzustellen, dass repräsentative Bereiche erfasst werden). Wiederholen Sie die Schritte 8.1 – 8,7 für funktionale Bewertung von den Rest der Kanäle.Hinweis: Es ist möglich, mehrere Kanäle gleichzeitig zu betreiben. Hierzu öffnen Sie alle Kanäle von Interesse während der Schritt 8.3. und führen Sie alle oben genannten Schritte 8.4 –8.7 für mehrere Kanäle von Interesse. 9. Abschluss der Assay und Reinigung der Mikrofluidik-Pumpe Exportieren Sie nach Abschluss des Experiments und speichern Sie alle Bilder im RAW-Format. Laufen Sie beim Speichern der Ergebnisse die mikrofluidischen Pumpe und die vielfältigen Reinigung Protokoll. Für die Pumpe mikrofluidischen Auswaschung/Pumpe Washout -Ordner zuerst von 4 mL Kultur Grade Zellwasser Vorrichtung laufen, gefolgt von 4 mL 80 % Ethanol wie beschrieben 6,6-6,7 trocknen die Pumpe durch die Luft für einige Minuten laufen. Um den Verteiler zu reinigen, laufen Sie Auswaschung/Krümmer Waschschritt mit der Spritze. Führen Sie die Schritte um die Spritze und die vielfältigen Ventile wie beschrieben Schritte 6.10-6.11 waschen zunächst mit 80 % Ethanol und nächsten mit Kultur Grade Zellwasser zu öffnen. Trocknen Sie die vielfältigen durch Luft über die Spritze drücken. Das Spritze-Ventil und die vielfältigen Ventile zu schließen, wie in beschrieben Schritte 6.10 und 6.15. 10. zählen der anhaftende Leukozyten Downloaden Sie und installieren Sie die Bildverarbeitungs-Software14 aus http://cellprofiler.org.Hinweis: Bildverarbeitung in dieser Studie erfolgte mittels Software Version 2.1.1. Wenn eine neuere Version verwenden, kann die Pipeline geringfügige Anpassung erfordern. Laden Sie die Pipeline Count_leukocytes.cpipe. Klicken Sie -Datei | Import | Pipeline aus der Datei und navigieren Sie auf PC, die Pipeline Count_leukocytes.cpipezu wählen. Ziehen Sie einen Ordner mit erworbenen RAW-Bilder von anhaftenden Leukozyten zum Fenster Datei Liste in die Eingabe-Module | Bilder Abschnitt für die Analyse. Geben Sie die typische Größe von Leukozyten über Analyse-Module | IdentifyPrimaryObjects. Geben Sie den minimalen und maximalen Durchmesser des anhaftenden Leukozyten in Pixel. Wählen Sie die Filterkriterien über Analyse-Module | FilterObjects. Die minimal akzeptierte Fläche eines Objekts in Pixel angeben. Starten Sie die Analyse durch Drücken der Taste ” Analyze Bilder “.Hinweis: Alle RAW-Bilder verarbeitet werden, und die Ergebnisse werden in einem Standard-Ausgabe-Ordner gespeichert werden. Die Image.txt Ausgabe-Datei enthält die Zahlen von anhaftenden Leukozyten in jedem bearbeiteten Bild (jede Zahl entspricht ein Bild, d. h. jeder erworbenen Sichtfeld).