Microfluidic Assay voor de beoordeling van leukocyten hechting op menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide endotheliale cellen (hiPSC-ECs)

1. bereiding van de oplossingen en reagentia Bereiden van volledige menselijke endotheliale-SFM medium (volledige EG-SFM) door toevoeging van bloedplaatjes-armen plasma bereide serum (1%), fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF, 20 ng/mL) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF, 50 ng/mL) aan menselijke endotheliale-SFM (Zie tabel van Materialen). Filtreer het medium door een 0,22 µm porie filter en sla het bij 4 ° C voor maximaal 2 weken. Bereiden van complete RPMI medium door het toevoegen van foetale runderserum (10%), 2-mercaptoethanol (0.05 nM), L-glutamine (1%), penicilline-streptomycine (25 U/mL) op RPMI gemiddeld (Zie Tabel van materialen). Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 3 weken. 2. coating van Microfluidic Chips Plaats een steriele biochip in een steriele petrischaal van 10 cm. Bereiden fibronectine werkoplossing door wederopvoering van de stockoplossing in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 +/Mg2 + om een eindconcentratie van 50 µg/mL. 80 µL van de werkoplossing per biochip schatten. Injecteren 10 µL van fibronectine werkoplossing in elk kanaal van de biochip. Gebruik een pipet met kleine 10 µL tips en zorg ervoor om te vormen van een strakke contact tussen de inlaat kanaal en het uiteinde van de Pipet (Figuur 1 c, links). Sluit het deksel van de petrischaal met de biochip en plaatst u deze in een bevochtigde kamer (figuur 2B). Bewaar de zaal bij 4 ° C’s nachts. Humidify van de zaal, plaats een schoon papieren zakdoekje op de bodem van de bevochtigde kamer en voeg 5 mL steriele H2O. Volgende dag, voordat de assay, warme vooraf de biochip bij 37 ° C in de incubator. 3. bereiding van hiPSC-ECs Opmerking: In het protocol hier beschreven, waren hiPSC-ECs gedifferentieerd, gezuiverd, cryopreserved en ontdooid als eerder beschreven8. Dooi en plaat hiPSC-ECs in volledige EG-SFM volledige in een 0,1% gelatine beklede T75 maatkolf, drie tot vier dagen vóór de bepaling. De nacht vóór de test, hiPSC-ECs met TNFα stimuleren door het toevoegen van volledige EG-SFM aangevuld met 10 ng/mL TNFα en incubeer overnachting (~ 12 h) bij 37 ° C, zoals eerder beschreven 7. 4. hiPSC-ECs dissociatie en Seeding in Microfluidic Chip Op de dag van de test, neem de kolf van hiPSC-ECs uit de incubator en de cellen onder de Microscoop onderzoeken. Zorg ervoor dat hiPSC-ECs 80 – 100% heuvels en een typische morfologie van de EG-achtige hebben. Breng de kolf in de cel cultuur kap. Het medium van de kolf van hiPSC-ECs gecombineerd. Kort was de cultuur van de cel door het toevoegen van 10 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. De PBS gecombineerd. Voeg 4 mL per fles van 1 x dissociatie enzym. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) (figuur 1B). Stop de dissociatie reactie door 8 mL van menselijke endotheliale-SFM medium per kolf toe te voegen. Voorzichtig losmaken en verzamelen van de opschorting van de hiPSC-ECs in een conische tube van 15 mL, met behulp van een precisiepipet 5 mL. Het totale aantal cellen in de schorsing te tellen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min op RT. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in volledige EG-SFM tot een eindconcentratie van 1.5 x 107 cellen/mL. Neem de petrischaal met de biochip uit de incubator en overbrengen naar de cel cultuur kap. Gecombineerd de fibronectine oplossing van alle kanalen van de microfluidic-chip. 6 µL van de celsuspensie injecteren op elk kanaal met behulp van een precisiepipet met een kleine 10 µL tip (Figuur 1 c, midden). Ervoor te zorgen dat de celsuspensie ruim vóór de injectie wordt gemengd en Vermijd cel neerslag. De biochip onder de Microscoop onderzoeken en ervoor zorgen dat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld, en de celdichtheid hoge (figuur 2C). Incubeer de biochip gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Voeg 40 µL van EG-SFM volledig in de middelgrote reservoirs aan beide zijden van elk kanaal. Incubeer de biochip gedurende 1 uur bij 37 ° C (Figuur 1 c, rechts). Voeg een andere 50 µL van EG-SFM volledig in de reservoirs aan beide zijden van elk kanaal. 5. bereiding van menselijke leukocyten Opmerking: In het protocol beschreven hier, werd een commercieel verkrijgbare monocytic cellijn (THP-1) gebruikt. Als alternatief, perifere bloed mononucleaire cellen of neutrofiele granulocyten kunnen worden gebruikt. Isolatie van perifeer bloed monocyten en neutrofielen kan worden uitgevoerd met behulp van de standaardprocedure11. Alle stappen die worden beschreven in deze paragraaf in een cel cultuur kap. Het verzamelen van de leukocyten in een conische tube van 50 mL. Wassen van de leukocyten met 10 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min op RT (Figuur 1 d). Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS met DiOC6 kleurstof (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Incubeer de cellen in het donker gedurende 10 minuten op RT. Wassen van de leukocyten met 10 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min op RT. Repeat de wassen stap één meer tijd. Het totale aantal cellen in de schorsing te tellen. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in volledige RPMI middellange tot een eindconcentratie van 2.5 x 106 cellen/mL. 6. bereiding van de Microfluidic pomp Monteer de microfluidic pomp met de 8-kanaals variëteit. Sluit de pomp aan op een PC met de geïnstalleerde besturingssysteemsoftware. Start de software microfluidic en laden van het protocol door te klikken op Open Protocol en ga op de PC om te selecteren van het microfluidic-protocol. Sluit de software en de pomp door de installatiemap te selecteren en te klikken op Uitvoeren Assay stap. Definiëren van de geometrie van de kanalen voor de juiste datatransportbesturing tarief: Selecteer Update meetkunde in de installatiemap voor de Meetkunde en klik op Run Assay stap.Opmerking: Ervoor te zorgen dat de geometrie gegevens overeenkomen met de spuit en de kanalen om te worden gebruikt (geometrie ID = 1, aantal kanalen = 8, kanaal breedte = 800.0 µm, kanaal diepte = 120.0 µm, Pompvolume = 250 µL) en de viscositeit van het monster (vloeibare viscositeit = 1.0). Het wassen van de pomp door het plaatsen van de inlaat-kabel (oranje) in de conische tube van 50 mL, met 80% ethanol. Plaats de stopcontact kabel (groen) in de conische lege tube van 50 mL (afval container). Selecteer de Wassen/pomp Washout -map en klik op Run Assay stap (wassen volume = 2000 µL, Wash volume stap = 250 µL, wassen richting = Output). Herhaal de wassen stap nog eens. Herhaal de stappen (stappen 6.6 – 6,7) met cel cultuur rang water en menselijke endotheliale-SFM kweekmedium wassen pomp. Ga verder met de stap van het wassen van de variëteit. Open de klep tussen de spuit en de variëteit handmatig door het plaatsen van de 3-weg-adapter in de juiste positie (indicator OFF aan de linkerkant staat). Selecteer Set huidige kanaal/Open stap in het Wassen/variëteit Wash -map en klik op Run Assay stap om te openen alle kleppen van de variëteit. De variëteit handmatig wassen door het indrukken van 5 mL ethanol 80% van de spuit, gevolgd door 5 mL cel cultuur rang water. De variëteit wassen door 5 mL menselijke endotheliale-SFM kweekmedium duwen van de spuit. Verwijder alle grote luchtbellen die zijn gevangen in de variëteit. Om dit te doen, de 8-well pins adapter in de 10 cm petrischaal met het medium plaatsen en het uitvoeren van duwen/trekken met de spuit totdat alle grote luchtbellen verdwenen zijn (kleine bubbels zijn geen probleem). Selecteer Set huidige kanaal/Close stap in het Wassen/variëteit Wash -map en klik op Run Assay stap om te sluiten alle kleppen van de variëteit. Sluit de kabel van de groene uitlaat van de pomp naar de inlaatspruitstuk adapter. De 3-wegkraan terugschakelen naar de uit -stand te sluiten van de spuit. Selecteer Wassen/kabel Washout -map en klik op Run Assay stap om te wassen elke poort met RPMI medium individueel, ervoor te zorgen dat alle bubbels zijn verwijderd uit elke kabel (afzien van volume = 100 µL).Opmerking: Elke klep van de variëteit is geopend één-door-één, 1 tot en met 8 en 100 μl van het medium wordt aangeboden via elk individueel kanaal terwijl het houden van de andere kanalen gesloten. Zorg ervoor dat de vloeistof van elke pin loopt. Als er geen vloeistof uit, is het een indicatie van een luchtbel of een klomp. 7. voorbereiding van de Microfluidic-Chip voor Live Imaging Ervoor zorgen dat de microfluidic opstellingen klaar zijn, en de levende imaging kamer vooraf equilibrated tot 37 ° C en het niveau van CO2 5% (figuur 3A, B bereikt). Neem de biochip uit de incubator en plaats deze in de Microscoop chip houder. Monteer de houder van de chip op de Microscoop imaging fase (Figuur 3 c). Om de biochip verbinden met de pomp via de variëteit, plaats de 8-pins adapter dicht mogelijk bij de uitlaat reservoirs van de chip en verdiepen van alle pinnen in het medium (maar sluit niet volledig). Selecteer de wassen | Verbinden met Chip map en klik op Run Assay stap af te zien van RPMI medium voorafgaand aan het aansluiten van de chip (afzien van volume = 30 mL). Zodra het medium wordt aangeboden, plaatst u de 8-pins adapter in het stopcontact van de biochip.Opmerking: Tijdens deze stap, alle kanalen zijn ingesteld op op (open) en 30 µL van het medium wordt aangeboden via elk kanaal en daarop de kanalen zijn ingesteld op Off (gesloten). Dit zorgt ervoor dat geen lucht bubbels zal worden ingevoerd in de kanalen van de microfluidic-chip. Handmatig gecombineerd het medium van alle reservoirs van de inlaat van de biochip met een pipet. Selecteer de wassen | Chip wassen map en klik op Run Assay stap naar perfuse 40 mL van volledige EG-SFM medium via elk van de kanalen één-door-één om zich te ontdoen van de dode cellen/puin van het kanaal (wassen volume = 40 µL, Maximum wassen schuintrekken = 40 dynes/cm2). 8. flow hechting Assay en overname van het beeld Handmatig gecombineerd het medium uit het reservoir van de inlaat van het kanaal van belang met een pipet. 100 µL van leukocyten uit stap 5.6 toevoegen aan het reservoir van de inlaat van het kanaal van belang.Opmerking: Meng voorzichtig de cellen om de schorsing van een eencellige. In de cel Assay | Stap beschrijving map, selecteer Set huidige kanaal/stap beschrijving , Selecteer in de lijst met kanalen, alleen het huidige kanaal van belang en ingesteld op On (open) en alle andere zeven kanalen ingesteld op Off (gesloten). Selecteer de cel Assay | Stap beschrijving map en klik op Run Assay stap.Opmerking: Ervoor te zorgen dat constante negatieve druk te trekken van de leukocyten schorsing uit het inlaat reservoir via het kanaal voor 5 min Variabele Flow Rate toedieningseenheden geldt (Shear reeks constante, Shear stress = = -0,5 dyne/cm2, duur = 00:05:00, Scan vertraging = 00:00:00). De negatieve waarde van shear stress zorgt voor de juiste richting van de stroom. De resterende leukocyten uit het reservoir inlaat gecombineerd. Voeg 100 µL van volledige RPMI medium naar het reservoir van de inlaat. Selecteer cel Assay/stap beschrijving map en klik op Run Assay stap om de perfuse van het kanaal voor 5 min met RPMI medium om te wassen van alle niet-aanhanger leukocyten (Shear reeks constante, Shear stress = = -0,5 dyne/cm2, duur = 00: 05:00, scanpauze = 00:00:00). Verwerven van beelden van ten minste drie tot vier verschillende positie’s van het kanaal om het imago van de zelfklevend leukocyten (om ervoor te zorgen dat er representatieve gebieden zijn gevangen). Herhaal stap 8.1-8,7 voor functionele beoordeling van al de rest van de kanalen.Opmerking: Het is mogelijk om meerdere kanalen tegelijk uitvoeren. Om dit te doen, opent u alle kanalen van belang tijdens de stap 8.3. en het uitvoeren van alle bovengenoemde stappen 8.4 –8.7 voor meerdere kanalen van belang. 9. de voltooiing van de test en het schoonmaken van de Microfluidic pomp Na het voltooien van het experiment, exporteren en opslaan van alle afbeeldingen in een RAW formaat. Uitvoeren tijdens het opslaan van de resultaten, de microfluidic-pomp en de variëteit schoonmaak protocol. Voor de microfluidic pomp, voer de map Vervagen/pomp wassen eerst door zoogdierlevercellen 4 mL cel cultuur rang water, gevolgd door 4 mL 80% ethanol zoals beschreven in stappen 6.6 – 6,7 drogen de pomp door het uitvoeren van lucht gedurende enkele minuten. Uitvoeren om het reinigen van de variëteit, Wassen/variëteit Wash stap met de spuit. Volg de stappen voor het openen van de spuit en de spruitstuk kleppen als beschreven in stappen 6.10-6.11 wassen eerst met 80% ethanol en volgende met cel cultuur rang water. Droog de variëteit door het duwen van lucht via de spuit. Sluit de klep van de spuit en de kleppen in het inlaatspruitstuk zoals beschreven in stappen 6.10 en 6.15. 10. tellen van aanhangend leukocyten Download en installeer de beeldverwerking software14 van http://cellprofiler.org.Opmerking: Beeldverwerking in deze studie werd uitgevoerd met behulp van software versie 2.1.1. Als een nieuwere versie, zou de pijpleiding voorschrijven dat kleine. Downloaden van de pijpleiding Count_leukocytes.cpipe. Klik op bestand | Import | Pijpleiding uit het bestand en ga op de PC om te kiezen van de pijpleiding Count_leukocytes.cpipe. Slepen en neerzetten een map met verworven RAW-afbeeldingen van aanhangend leukocyten naar het bestand lijstvenster in de Input-modules | Beelden sectie voor analyse. Geef de typische grootte van leukocyten via analyse modules | IdentifyPrimaryObjects. De minimale en maximale diameter van aanhangend leukocyten in pixels opgeven. Selecteer de filtercriteria via analyse modules | FilterObjects. Geef het minimaal geaccepteerde gebied van objecten in pixels. Begin de analyse door op de knop analyseren beelden .Opmerking: Alle RAW beelden worden verwerkt en de resultaten worden opgeslagen in een standaardmap voor uitvoer. Het Image.txt -uitvoerbestand bevat het aantal aanhangend leukocyten in elke verwerkte beeld (elk nummer correspondeert met een afbeelding, dat wil zeggen, elke verworven gezichtsveld).