Microfluidic Assay для оценки лейкоцитарной адгезии к человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток (hiPSC-ECs)

1. Подготовка растворов и реагентов Подготовка полного среднего человека Endothelial-УЛП (EC-УЛП полная), добавляя тромбоцитов плохой плазмы производные сыворотки (1%), основные фибробластический фактор роста (bFGF, 20 нг/мл) и Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF, 50 нг/мл) для человека Endothelial-УЛП (см. таблицы Материалы). Через поры фильтра 0.22 мкм фильтр средних и хранить его на 4 ° C на срок до 2 недель. Подготовка полного среднего RPMI, добавив плода бычьим сывороточным (10%), 2-меркаптоэтанол (0,05 Нм), L-глютамин (1%), пенициллин-стрептомицином (25 ед/мл) RPMI средний (см. Таблицу материалы). Хранить при 4 ° C до 3 недель. 2. покрытие Microfluidic чипсы Место стерильным биочип в Петри стерильные 10 см. Подготовьте фибронектин рабочего раствора путем воссоздания Стоковый раствор в фосфат амортизированное saline (PBS) без Ca2 +/Mg2 + до конечной концентрации 50 мкг/мл. По оценкам 80 мкл рабочего раствора на биочип. Inject 10 мкл рабочего раствора фибронектин в каждом канале биочип. Использование пипетки с небольшой 10 мкл советы и убедитесь, что образуют плотный контакт между впускного канала и наконечник пипетки (рис. 1 c, слева). Закройте крышку Петри, содержащие биочип и поместите его в камере увлажненные (рис. 2B). Храните в камере при температуре 4 ° C на ночь. Чтобы увлажнить палата, место чистой папиросной бумаги в нижней палаты увлажненные и добавьте 5 мл стерильной H2O. Следующий день, перед assay, предварительно теплой биочип при 37 ° C в инкубаторе. 3. Подготовка hiPSC-ECs Примечание: В протоколе, описанные здесь hiPSC-ECs были продифференцированы, очищенный, замораживают и растаяло как описано выше8. Оттепель и плита hiPSC-ECs в полной полный EC-УЛП в одном 0,1% желатина покрытием T75 колбу, три-четыре дня до assay. Ночь перед assay, стимулировать hiPSC-ECs с TNFα, добавив EC-УЛП полный дополнена 10 нг/мл TNFα и инкубировать на ночь (~ 12 ч) при 37 ° C, как описано выше 7. 4. hiPSC-ECs диссоциации и посев в Microfluidic чип В день assay принимать настой hiPSC-ECs из инкубатора и изучить клетки под микроскопом. Убедитесь, что hiPSC-ECs 80 – 100% притока и имеют типичный EC-как морфология. Перевести колбу на капот культуры клеток. Аспирационная среднего из колбы hiPSC-ECs. Кратко мыть клеточной культуры путем добавления 10 мл PBS без Ca2 +/Mg2 +. Аспирационная PBS. Добавьте 4 мл флакон 1 x диссоциации фермента. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре (RT) (рис. 1B). Остановите реакции диссоциации, добавив 8 мл среды человеческого Endothelial-УЛП за флакон. Аккуратно отсоедините и собирать hiPSC-ECs подвеска в 15 мл Конические трубки с помощью пипетки 5 мл. Подсчитать общее количество клеток в суспензии. Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин на RT. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в полной EC-УЛП в конечной концентрации 1,5 x 10-7 кл/мл. Возьмите Петри с биочип из инкубатора и перенести его на капот культуры клеток. Аспирационная фибронектин решение от всех каналов microfluidic чипа. Inject 6 мкл суспензии клеток в каждый канал с помощью пипетки с небольшой 10 мкл наконечником (рис. 1 c, средние). Убедитесь, что суспензию клеток смешивается задолго до инъекции и избежать клеток осадков. Проверьте биочип под микроскопом и убедитесь, что ячейки равномерно распределены, и высокая плотность клеток (рис. 2 c). Инкубировать биочип 15 мин при температуре 37 ° C. Мкл 40 полный EC-УЛП в средних водоемы с обеих сторон каждого канала. Инкубируйте биочип за 1 ч при 37 ° C (рис. 1 c, право). Еще 50 мкл полный EC-УЛП в водоемы с обеих сторон каждого канала. 5. Подготовка лейкоциты человека Примечание: В протоколе, описанные здесь был использован коммерчески доступных monocytic клеток линии (THP-1). В качестве альтернативы может использоваться мононуклеаров периферической крови или нейтрофилов. Изоляции периферической крови моноцитов и нейтрофилов может производиться с использованием стандартной процедуры11. Выполните все шаги, описанные в этом пункте в капюшоне культуры клеток. Соберите лейкоцитов в 50 мл Конические трубки. Вымойте лейкоциты с 10 мл PBS без Ca2 +/Mg2 +. Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин на RT (рис. 1 d). Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS с DiOC6 краситель (λex = 485 Нм, λет = 501 Нм) (1:5, 000). Инкубировать клетки в темноте за 10 мин на RT. Вымойте лейкоциты с 10 мл PBS без Ca2 +/Mg2 +. Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин на RT. Repeat Стиральная шаг еще раз. Подсчитать общее количество клеток в суспензии. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в полной RPMI среднего до конечной концентрации 2,5 х 106 клеток/мл. 6. Подготовка Microfluidic насоса Соберите насос microfluidic с 8-канальный коллектор. Подключите насос к компьютеру с установленной программное обеспечение. Запустите программу microfluidic и загрузить протокол, нажав Открытый протокол и перейдите на ПК для выбора протокола microfluidic. Подключение программного обеспечения и насос, выбрав папку установки и нажав Запустить шаг Assay. Определение геометрии каналов для правильного потока скорость контроля: выберите Обновление геометрии в папке Установки геометрии и нажмите Запустить шаг Assay.Примечание: Убедитесь, что геометрические детали соответствуют шприц и каналы, которые будут использоваться (геометрии ID = 1, количество каналов = 8, ширина канала = 800.0 мкм, глубина канала = 120.0 мкм, объем шприца = 250 мкл) и вязкости образца (жидкости вязкость = 1.0). Промойте насос, поместив входной кабель (оранжевый) в 50 мл конические трубка, содержащая 80% этанола. Место выхода кабеля (зеленый) в конической пустой Тюбик 50 мл (контейнер для отходов). Выберите папку Размыва/насос размыва и нажмите Запустить Assay шаг (мыть объем = 2000 мкл, мыть объем шаг = 250 мкл, размыва направление = выход). Стиральная Повторите еще раз. Повторите насоса Стиральная шаги (шаги 6.6 – 6,7) клеток культуры класс водой, и человека Endothelial-УЛП питательной среды. Продолжите выполнение шага Стиральная коллектора. Вручную откройте клапан между шприц и коллектора, поставив адаптер 3-way в правильное положение (индикатор OFF повернул налево). Выберите Набор текущий канал/открыть шаг в папке Размыва/коллектор мыть и нажмите Запустить Assay шаг откроет все клапаны коллектора. Вымойте коллектор вручную, нажав 5 мл 80% этанола из шприца, следуют 5 мл воды класса культуры клеток. Вымойте коллектора, нажав 5 мл человека Endothelial-УЛП питательной среды из шприца. Удалите все большие воздушные пузыри, которые оказались в ловушке в коллекторе. Чтобы сделать это, поместите 8-Ну контактный адаптер в 10 см Петри со средой и выполнять толкания/потянув с шприца до тех пор, пока все большие воздушные пузырьки исчезли (маленькие пузырьки являются не проблемой). Выберите Набор текущий канал/закрыть шаг в папке Размыва/коллектор мыть и нажмите Запустить шаг Assay закрыть все клапаны коллектора. Подключите кабель зеленые розетки от насоса к коллектор адаптер. Переключатель 3-ходовой клапан обратно в положение ” OFF ” для закрытия шприца. Выберите папку Размыва размыва/кабель и нажмите Запустить шаг Assay мыть каждый порт среду RPMI индивидуально, обеспечение того, что все пузыри удаляются из каждого кабеля (распределять объем = 100 мкл).Примечание: Каждый клапан коллектора открыт один в 1, 1-8 и 100 мкл среды распределяется через каждого отдельного канала, в то время как сохраняя другие каналы закрыты. Убедитесь, что жидкость проходит от каждого PIN-код. Если жидкости не выходит, это признак воздушный пузырь или засорить. 7. Подготовка Microfluidic чип для жить изображений Убедитесь, что готовы microfluidic установок и живой тепловизионные камеры предварительного уравновешенной до 37 ° C и уровень CO2 достигает 5% (Рисунок 3А, B). Возьмите биочип из инкубатора и расположите его в держатель чип микроскопа. Смонтируйте держатель чип на микроскопе изображение стадии (рис. 3 c). Чтобы подключить биочип с насосом через коллектор, место 8-контактный адаптер недалеко от водохранилища выходе чипа и углублять все контакты в среде (но не подключайте полностью). Выберите обесцветить | Подключиться к чип папку и нажмите Запустить шаг Assay отказаться RPMI среднего до подключения чип (распределять объем = 30 мл). После того, как носитель разливают, вставьте 8-контактный адаптер в розетку биочип.Примечание: Во время этого шага все каналы установлены на (открытый) и 30 мкл среды распределяется через каждый канал и после этого каналы устанавливаются Off (закрытые). Это гарантирует, что нет воздуха, что пузыри будут вводиться в каналы microfluidic чипа. Вручную удалить средство от всех водохранилищ входе биочип с пипеткой. Выберите обесцветить | Чип размыва папку и нажмите кнопку Запустить Assay шаг к perfuse 40 мл EC-УЛП полной среды через каждого из каналов по одному, чтобы избавиться от мертвых клеток/мусора из канала (объем смыва = 40 мкл, максимум размыва сдвига = 40 дин/см2). 8. поток адгезии пробирного и видеосъемка Вручную удалить носитель из водохранилища впускного канала интерес с пипеткой. Добавьте 100 мкл лейкоциты с шагом 5.6 водохранилище впускного канала интерес.Примечание: Аккуратно перемешайте ячеек для подвески одной ячейки. В Assay клетки | Шаг описание папку, выберите Набор текущий канал/шаг описание и, в списке каналов, выберите только текущий канал интерес и установить на (открытый) и установить все семь каналов Off (закрытые). Выберите Assay клетки | Шаг описание папку и нажмите кнопку Запустить шаг Assay.Примечание: Убедитесь, что Переменная скорость потока дозирования применяется постоянная отрицательное давление тянуть лейкоцита подвеска из входе водохранилища через канал 5 мин (ножницы набор = константа, касательное напряжение = -0,5 дин/см2, длительность = 00:05:00, Сканировать задержка = 00:00:00). Отрицательное значение напряжения сдвига обеспечивает правильное направление потока. Аспирационная оставшиеся лейкоцитов из впускного коллектора. Добавьте 100 мкл полного среднего RPMI впускного коллектора. Выберите ячейку Assay/шаг описание папку и нажмите Запустить Assay шаг к perfuse канал на 5 мин с RPMI среднего для того, чтобы промыть все non сторонник лейкоцитов (ножницы набор = константа, касательное напряжение = -0,5 дин/см2, длительность = 00: 05:00, сканирования задержка = 00:00:00). Получение изображений из различных позиций по крайней мере три-четыре канала изображения придерживался лейкоцитов (чтобы убедиться, что представитель области зафиксированы). Повторите шаги 8.1 – 8,7 для функциональной оценки всех остальных каналов.Примечание: Это возможно для запуска нескольких каналов одновременно. Чтобы сделать это, откройте все каналы интерес во время шага 8.3. и выполнить все вышеупомянутые шаги 8.4 –8.7 для нескольких каналов интерес. 9. Завершение анализа и очистки Microfluidic насос После завершения эксперимента, экспортировать и сохранить все изображения в формате RAW. При сохранении результатов, запустите насос microfluidic и коллектором, очистка протокол. Для microfluidic насоса сначала запустите папке Размыва/насос размыва , perfusing 4 мл воды класса культуры клеток, следуют 4 мл 80% этанола, как описано в шагах 6.6 – 6.7 сухой насос, запустив воздуха в течение нескольких минут. Для того чтобы очистить коллектор, выполните шаг Размыва/коллектор мыть с шприца. Выполните шаги для открытия шприц и многообразие клапаны, как описано в шагах 6.10-6.11 мыть впервые с 80% этанола и следующий с водой класса культуры клеток. Сухие коллектора, нажав воздуха через шприц. Закройте клапан шприц и многообразие клапаны, как описано в шагах 6.10 и 6.15. 10. Подсчет адэрентных лейкоцитов Скачать и установить программное обеспечение14 от http://cellprofiler.org обработки изображений.Примечание: Обработки изображений в этом исследовании была выполнена с использованием программного обеспечения версии 2.1.1. При использовании более новой версии, конвейер может потребоваться незначительные адаптации. Скачать конвейера Count_leukocytes.cpipe. Щелкните файл | Импорт | Трубопровод из файла и перейдите на PC выбрать трубопровода Count_leukocytes.cpipe. Перетащите папку с приобретенными RAW изображений адэрентных лейкоцитов в окно Список файлов в ввода модулей | Изображения секции для анализа. Укажите типичный размер лейкоцитов через анализ модули | IdentifyPrimaryObjects. Укажите минимальный и максимальный диаметр адэрентных лейкоцитов в пикселях. Выберите критерии фильтрации через анализ модули | FilterObjects. Укажите области минимально признанных объектов в пикселях. Запустите анализ, нажав на кнопку Analyze изображения .Примечание: Все исходные изображения будут обработаны, и результаты будут сохранены в папке выходных данных по умолчанию. Выходной файл Image.txt содержит количество адэрентных лейкоцитов в каждом обработанные изображения (каждое число соответствует одно изображение, то есть, каждый приобретенных поле зрения).