Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

1. הכנת פתרונות, ריאגנטים להכין בינוני Endothelial אנושי-SFM מלאה (EC-SFM מלאות) על-ידי הוספת סרום פלזמה, נגזר טסית דם-עני (1%), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF, 20 ng/mL), כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF, 50 ng/mL) כדי האנושי Endothelial-SFM (ראה טבלה של חומרים). לסנן את המדיום דרך מסנן נקבובית מיקרומטר 0.22 ואחסן אותו ב 4 ° C עד 2 שבועות. להכין בינוני RPMI מלאה על-ידי הוספת סרום שור עוברית (10%), מרקפטואתנול (0.05 nM),-גלוטמין (1%), פניצילין-סטרפטומיצין (25 U/mL) לבינונית RPMI (ראה טבלה של חומרים). לאחסן ב 4 ° C עד 3 שבועות. 2. ציפוי של Microfluidic צ’יפס המקום ביו-שבב סטרילי לתוך צלחת פטרי 10 ס מ סטרילי. הכן fibronectin הפתרון עובד על ידי לשחזר את הפתרון מניות ב באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא Ca2 +/Mg2 + כדי ריכוז סופי של 50 µg/mL. מעריכים µL 80 של הפתרון עובד לכל ביו-שבב. מזריקים µL 10 של הפתרון עובד fibronectin לתוך כל אחד מהערוצים ביו-שבב. השתמש פיפטה עם טיפים קטנים µL 10 וודא כי ליצור איש קשר הדוק בין הים ערוץ הטיפ פיפטה (איור 1C, משמאל). סגור את המכסה של הפטרי המכיל את ביו-שבב ומניחים אותו בתוך תא humidified (איור 2B). חנות התא ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ללחלוח התא, מקום נקי של ממחטת נייר בתחתית תא humidified, הוסף 5 מ של סטרילי H2O. למחרת, לפני וזמינותו, לחמם את ביו-שבב ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. 3. הכנת hiPSC-ECs הערה: בפרוטוקול המתוארים כאן, hiPSC-ECs הבדיל, טיהור, cryopreserved, הקרת כפי שתואר לעיל8. הפשרה וצלחת hiPSC-ECs ב מלאה EC-SFM מלא לתוך אחד 0.1% מצופי ג’לטין T75 הבקבוק, שלושה-ארבעה ימים לפני וזמינותו. בלילה לפני וזמינותו, לעורר hiPSC-ECs עם TNFα על-ידי הוספת EC-SFM מלא בתוספת 10 ננוגרם למ”ל TNFα, דגירה לילה (~ 12 h) ב 37 מעלות צלזיוס, כפי שתואר לעיל 7. 4. hiPSC-ECs דיסוציאציה, זריעת לתוך השבב Microfluidic ביום של וזמינותו, לקחת את הבקבוק של hiPSC-ECs מן החממה ולבחון את התאים במיקרוסקופ. ודא כי hiPSC-ECs 80 – 100% confluent, יש מורפולוגיה EC דמוי טיפוסי. להעביר את הבקבוקון וחטף התרבות תאים. האחות האמצעי הבקבוק של hiPSC-ECs. בקצרה לשטוף את התרבות התא על-ידי הוספת 10 מ”ל של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 4 מ”ל לכל הבקבוקון של האנזים דיסוציאציה 1 x. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 1B). לעצור את התגובה דיסוציאציה על-ידי הוספת 8 מ ל Endothelial אנושי-SFM בינוני לכל את הבקבוק. בעדינות לנתק ולאסוף את המתלה hiPSC-ECs 15 מ”ל צינור חרוטי באמצעות פיפטה 5 מ. לספור את המספר הכולל של תאי ההשעיה. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב- RT. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- EC-SFM מלא כדי ריכוז סופי של 1.5 x 107 תאים למ”ל. להוציא את צלחת פטרי עם ביו-שבב של החממה, להעביר אותו למכסה התרבות תאים. האחות הפתרון fibronectin של כל הערוצים של שבב microfluidic. מזריקים µL 6 של התליה תא לתוך אחד מהערוצים באמצעות פיפטה עם טיפ קטן µL 10 (איור 1C, התיכון). ודא כי התליה תא מעורבב היטב לפני הזריקה ולהימנע תא משקעים. לבחון את ביו-שבב מתחת למיקרוסקופ ולהבטיח כי התאים מפוזרים בצורה אחידה, צפיפות התאים היא גבוהה (איור 2C). דגירה של ביו-שבב למשך 15 דקות ב 37 º C. הוסף µL 40 של EC-SFM מלא לתוך המאגרים בינוני משני הצדדים של כל ערוץ. דגירה של ביו-שבב עבור h 1 ° 37 C (איור 1C, נכון). להוסיף עוד 50 µL של EC-SFM מלא לתוך המאגרים משני הצדדים של כל ערוץ. 5. הכנת לויקוציטים אנושיים הערה: פרוטוקול המתוארים כאן, שימשה קו תא monocytic זמינים מסחרית (THP-1). לחלופין, ניתן להשתמש תאי תאי דם היקפיים או נויטרופילים. בידוד של דם היקפיים ומונוציטים ו נויטרופילים יכול להתבצע באמצעות הליך סטנדרטי11. בצע את כל השלבים המתוארים בפסקה זו בשכונה התרבות תאים. איסוף על לויקוציטים צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את לויקוציטים עם 10 מ”ל של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב RT (איור 1D). וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ”ל של PBS עם DiOC6 צבע (λex = 485 ננומטר, λem = 501 ננומטר) (1:5, 000). דגירה התאים בחושך למשך 10 דקות ב- RT. לשטוף את לויקוציטים עם 10 מ”ל של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב RT. חזור על השלב כביסה עוד פעם אחת. לספור את המספר הכולל של תאי ההשעיה. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא בינוני RPMI מלאה כדי ריכוז סופי של 2.5 x 106 תאים למ”ל. 6. הכנת המשאבה Microfluidic להרכיב את המשאבה microfluidic עם יריעה ערוץ 8. לחבר את המשאבה מחשב עם התוכנה ההפעלה המותקנת. להפעיל את התוכנה microfluidic, לטעון את הפרוטוקול על ידי לחיצה על פרוטוקול פתוח ונווט במחשב כדי לבחור את הפרוטוקול microfluidic. מחברים את התוכנה המשאבה על-ידי בחירת תיקיית ההתקנה ולחיצה לרוץ צעד וזמינותו. להגדיר את הגיאומטריה של הערוצים עבור הפקד קצב זרימה נכונה: בחר עדכון הגיאומטריה בתיקיית ההתקנה הגיאומטריה ולחץ להפעיל שלב וזמינותו.הערה: ודא הפרטים הגיאומטריה תואמים את המזרק ואת ערוצי כדי לשמש (גאומטריה מזהה = 1, מספר ערוצים = 8, רוחב הערוץ = מיקרומטר 800.0, ערוץ עומק = מיקרומטר 120.0, מזרק נפח = 250 µL), צמיגות של המדגם (צמיגות הנוזל = 1.0). לשטוף את המשאבה על-ידי הצבת את כניסת כבל (כתום) לתוך הצינור חרוט 50 מ ל המכילה 80% אתנול. מקם את הכבל לשקע (ירוק) בצינור 50 מ ל חרוט ריק (פח אשפה). בחר את התיקיה שטיפה/משאבה שטיפה ולחץ על הפעל שלב Assay (לשטוף נפח = 2000 µL, שטיפת נפח שלב = 250 µL, כיוון שטיפה = פלט). חזור על השלב כביסה פעם נוספת. חזור על המשאבה שטיפת מדרגות (שלבים 6.6 – 6.7) עם תא תרבות כיתה ומים Endothelial אנושי-SFM תרבות בינוני. המשך לשלב הכביסה של יריעה. באופן ידני לפתוח את השסתום בין המזרק את סעפת על-ידי הצבת המתאם 3-way אל המיקום הנכון (מחוון OFF מופעל משמאל). בחר ערכת זרם ערוץ/פתיחה שלב בתיקיה שטיפה/יריעה לשטוף ‘ ולחץ על ‘ לרוץ צעד Assay לפתוח שסתומים של יריעה ‘. לשטוף את יריעה באופן ידני על ידי דחיפת 5 מ ל 80% אתנול מן המזרק, ואחריו 5 מיליליטר מים כיתה של התרבות תאים. לשטוף את יריעה על ידי דחיפת 5 מיליליטר Endothelial אנושי-SFM תרבות בינוני של המזרק. להסיר את כל הבועות אוויר גדולים כי הם לכודים בתוך יריעה. כדי לעשות זאת, למקם את מתאם ה pin 8-ובכן 10 ס צלחת פטרי עם המדיום ולבצע דוחפים/משיכת עם המזרק עד כל בועות אוויר גדולים נעלמו (בועות קטנות אינם בעיה). בחר ערכת זרם ערוץ/סגור שלב בתיקיה שטיפה/יריעה לשטוף ‘ ולחץ על ‘ לרוץ צעד Assay לסגור כל השסתומים של יריעה ‘. חבר את הכבל לשקע ירוק מהמשאבה על המתאם סעפת. להחליף את השסתום 3-דרך חזרה למצב כבוי כדי לסגור את המזרק. בחר תיקיה שטיפה/כבלים שטיפה ולחץ לרוץ צעד Assay לשטוף כל יציאה RPMI בינונית בנפרד, ולהבטיח כי כל הבועות יוסרו כל כבל (לוותר על נפח = 100 µL).הערה: כל שסתום של סעפת נפתח אחד–אחד, 1 עד 8, ו- 100 μL של המדיום הוא בגליל דרך אחד מהערוצים בודדים תוך שמירה על הערוצים האחרים סגור. ודא כי הנוזל מקשר בין כל סיכה. אם אין נוזל יוצא החוצה, זה מעיד על בועת אוויר או להדביק. 7. הכנת השבב Microfluidic עבור Live הדמיה ודא הכיוונונים microfluidic מוכנים, ו תא הדמיה חיה מראש equilibrated ל- 37 ° C רמת CO2 מגיע ל- 5% (איור 3 א, ב’). קח את ביו-שבב מן החממה ומקם אותה במיקרוסקופ בעל שבב. הר בעל שבב על המיקרוסקופ הדמיה הבמה (איור 3C). כדי להתחבר ביו-שבב את המשאבה דרך סעפת, למקם את המתאם 8 פינים קרוב לשקע המאגרים של השבב, להעמיק את כל הפינים במדיום (אך אל תחבר לחלוטין). בחר הכשלון | להתחבר שבב תיקיה ולחץ לרוץ צעד Assay כדי לוותר על RPMI בינוני לפני חיבור השבב (לוותר על נפח = 30 מ ל). ברגע המדיום הוא בגליל, הכנס המתאם 8 פינים בשקע של ביו-שבב.הערה: במהלך שלב זה, כל הערוצים מוגדרים כך על (פתוח) 30 µL של המדיום הוא בגליל דרך כל ערוץ ו בעקבות זאת הערוצים מוגדרות Off (סגור). פעולה זו מבטיחה כי אין אוויר בועות יוכנסו לתוך הערוצים של שבב microfluidic. בוער המדיום כל כניסת ממאגרים של ביו-שבב עם פיפטה. בחר הכשלון | צ’יפ הכשלון תיקיה ולחץ לרוץ צעד Assay perfuse 40 מיליליטר בינוני מלא EC-SFM דרך כל הערוצים אחד–אחד כדי להיפטר התאים מתים/פסולת מן התעלה (שטיפה נפח = 40 µL, מקסימום שטיפה הטיה = 40 dynes/cm2). 8. זרימה אדהזיה Assay התמונה רכישה בוער המדיום מן המאגר כניסת של הערוץ מעניין בעזרת פיפטה. להוסיף 100 µL של לויקוציטים 5.6 צעד אל המאגר כניסת של הערוץ עניין.הערה: מערבבים בעדינות את התאים לבצע השעיה תא בודד. ב וזמינותו תא | תיאור שלב תיקיה, בחר תיאור ערכת זרם ערוץ/שלב , ברשימה של ערוצים, בחר רק את הערוץ הנוכחי של עניין, מוגדר על (פתוח) ולהגדיר כל הערוצים שבעה אחרים מחוץ (סגור). בחר וזמינותו תא | תיאור שלב תיקיה ולחץ לרוץ צעד וזמינותו.הערה: ודא כי משתנה Flow Rate Dispensing חל לחץ שלילי קבוע למשוך את המתלים ליקוציט מן המאגר כניסת דרך הערוץ במשך 5 דקות (הטיה סט = קבוע, גזירה = דיין -0.5/cm2, משך = 05: 00:00, סרוק עיכוב = 00:00:00). ערך שלילי של גזירה מבטיחה הכיוון הנכון של הזרם. האחות של לויקוציטים שנותרו מן המאגר מפרץ צר. להוסיף 100 µL בינוני RPMI מלאה למאגר כניסת המים. בחר תיקיה תיאור תא Assay/שלב ולחץ לרוץ צעד Assay כדי perfuse את ערוץ 5 דקות RPMI בינונית כדי לשטוף את כל שאינו דוגל לויקוציטים (הטיה סט = קבוע, גזירה = דיין -0.5/cm2, משך זמן = 00: 05:00, סריקה עיכוב = 00:00:00). לרכוש תמונות לפחות שלוש עד ארבע עמדות שונות של הערוץ לשיקוף של לויקוציטים מודבקת (כדי להבטיח כי אזורים נציג נלכדים). חזור על שלבים 8.1-8.7 להערכה תפקודית של כל שאר הערוצים.הערה: זה אפשרי להפעיל ערוצים מרובים בו-זמנית. לשם כך, פתח כל ערוצי עניין במהלך 8.3 שלב. ולבצע כל השלבים הנ ל 8.4 –8.7 עבור ערוצים מרובים של עניין. 9. השלמת וזמינותו, ניקוי המשאבה Microfluidic לאחר סיום הניסוי, לייצא ולשמור כל תמונות בתבנית RAW. בעת שמירת התוצאות, להפעיל את המשאבה microfluidic את סעפת ניקוי פרוטוקול. המשאבה microfluidic, ראשית הפעל את התיקיה שטיפה/משאבה שטיפה מאת פרפוזיה 4 מיליליטר מים כיתה תרבות תא, ואחריו 4 מ ל 80% אתנול כמתואר בצעדים 6.6 – 6.7 לייבש את המשאבה על-ידי הפעלת האוויר למשך מספר דקות. כדי לנקות את סעפת, הפעל את שלב שטיפה/יריעה לשטוף עם המזרק. בצע את השלבים לפתיחת המזרק ושסתומים סעפת כמו שמתואר צעדים 6.10-6.11 לשטוף תחילה עם 80% אתנול הבא עם תא תרבות כיתה מים. יבש את יריעה על ידי דחיפת אויר דרך המזרק. סגור את השסתום מזרק ושסתומים סעפת כמתואר ב- 6.10 שלבים ו- 6.15. 10. סופר של לויקוציטים חסיד הורד והתקן את התמונה עיבוד תוכנה14 מ http://cellprofiler.org.הערה: עיבוד במחקר זה תמונה בוצעה באמצעות תוכנה גירסה 2.1.1. אם משתמש גירסה חדשה יותר, הצינור עשוי לדרוש התאמה משנית. הורד את הצינור Count_leukocytes.cpipe. לחץ על קובץ | ייבוא | צינור מתוך הקובץ ונווט במחשב כדי לבחור את הצינור Count_leukocytes.cpipe. גרור-ושחרר תיקיה עם תמונות RAW הנרכש של לויקוציטים חסיד אל חלון רשימת הקבצים במודולים קלט | תמונות סעיף לניתוח. לציין את גודל טיפוסי של לויקוציטים באמצעות מודולים ניתוח | IdentifyPrimaryObjects. לציין את קוטר מינימלי, מקסימלי של לויקוציטים חסיד בפיקסלים. בחר את הקריטריונים הסינון באמצעות מודולים ניתוח | FilterObjects. לציין את האזור מקובל מינימלית של אובייקטים בפיקסלים. להתחיל את הניתוח על-ידי לחיצה על כפתור ניתוח תמונות .הערה: כל התמונות RAW יעובדו, התוצאות יישמרו בתיקיית ברירת מחדל פלט. קובץ הפלט Image.txt מכיל את המספרים של לויקוציטים חסיד של כל תמונה מעובד (כל מספר המתאים תמונה אחת, קרי, כל תצוגה של שדה הנרכש).