Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

O papel dos vasos linfáticos e LECs no fígado não é bem compreendido. Enquanto os vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal do fígado¹ e expandem durante a doença², muito pouco é compreendido em relação à função e fenótipo de LECs dentro do fígado. Com a descoberta de marcadores que são encontrados principalmente no LECs³, a importância destas células dentro de nichos diferentes tecidos na homeostase e na doença preencherá uma lacuna significativa na nossa compreensão. LECs têm um papel importante na manutenção da tolerância periférica no nó de linfa e em tumores metastáticos interagindo diretamente com T células^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs no nó de linfa podem promover imunidade protetora através de suas interações com células dendríticas migratórias^14,15,16. Portanto, existem várias funções para LECs, que podem ser específicas para os tecidos e as interações em que estão presentes. No entanto, muito pouco é compreendido sobre como LECs interagem com células do sistema imunológico no tecido ou como LECs funcionam em diferentes órgãos; assim, avaliar LECs em uma base por célula dentro do fígado ou outros órgãos pode levar a avanços na como LECs program a imunidade do tecido-específica. Enquanto grande parte da literatura que enfoca LECs no fígado usa microscopia Visualizar LECs usando um ou dois marcadores e morfologia¹⁷, muito pouco tem sido feito para avaliar especificamente LECs em uma base de célula por célula usando citometria de fluxo, embora um estudo avaliar as diferenças entre células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) e LECs¹⁸. Ser capaz de analisar as populações do LEC no fígado por citometria de fluxo permite o estudo aprofundado de fenótipo LEC durante homeostase normal ou doença.

Para avaliar os LECs por citometria de fluxo, são necessários vários marcadores de superfície. Normalmente, LECs são visualizados pela expressão de prospero relacionados homeobox 1 (Prox-1), receptor de ácido hialurônico endoteliais de vasos linfáticos 1 (LYVE1) ou do receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR3) usando microscopia. No entanto, no fígado, a expressão destes marcadores não está restrita a LECs. Prox-1 é amplamente expresso pelos hepatócitos durante o desenvolvimento do fígado, regeneração e lesão¹⁹e LYVE1 e VEGFR3 são expressos por células endoteliais sinusoidais fígado¹⁸. No nó de linfa, LECs são identificados usando citometria de fluxo como aglomerados de diferenciação (CD) CD45, CD31 + e podoplanin + (PDPN)¹⁶. No entanto, esta abordagem é também mínima para isolar LECs no fígado, desde células CD45 – CD31 + irão capturar as células endoteliais, e a população predominante de pilhas endothelial vasculares no fígado é LSECs. Assim, outros marcadores são necessários para distinguir a população LEC rara da população abundante de LSEC. Tanto CD16/32 (expressado por maduro LSECs¹⁸) e CD146 (um célula endotelial vascular marcador comum que é predominantemente expressado dentro os sinusoides do fígado por células endoteliais sinusoidais fígado²⁰ com pouca ou nenhuma expressão por linfático células endoteliais²¹) foram os marcadores de candidato.

Portanto, nós aperfeiçoamos um método para isolar e visualizando LECs no fígado usando o acima marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e PDPN por citometria de fluxo. Nós descrevemos o uso de colagenase IV, 1 DNase e separação mecânica para a digestão do tecido do fígado em uma suspensão de célula única. Também descrevemos a utilização de gradiente de densidade iodixanol para o isolamento de células não-parenquimatosas (NPC) e eliminar restos celulares. Finalmente, usando vários marcadores, determinamos a estratégia associada citometria de fluxo ideal para identificar LECs do fígado com PDPN como o marcador predominante.