Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.
Binnen de lever, lymfevaten binnen de portal triad worden gevonden, en hun beschreven functie is om de interstitiële vloeistof van de lever naar de lymfeklieren waar cellulaire puin en antigenen kunnen worden onderzocht. Wij zijn zeer geïnteresseerd in het begrip van hoe de lymfatische therapieën kan worden betrokken bij de ontsteking en immuun cel functie binnen de lever. Echter zeer weinig is gepubliceerd tot oprichting van de spijsvertering protocollen voor de isolatie van lymfatische endotheliale cellen van de lever of de specifieke markeringen die kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de lever (LECs) LECS-server op basis van de per cel. Daarom geoptimaliseerd we een methode voor de spijsvertering en de kleuring van de lever om te evalueren van de LEC-bevolking in de lever. Wij zijn ervan overtuigd dat de hier geschetste methode nuttig voor de identificatie en de isolatie van de LECS-server uit de lever zijn zal en ons begrip van hoe de LECS-server op de lever communicatie reageren zal versterken.
De rol van lymfevaten en de LECS-server in de lever niet goed wordt begrepen. Terwijl lymfevaten zijn te in de portal triade van de lever1 vinden en uit te tijdens ziekte2 breiden, is weinig begrepen met betrekking tot de functie en het fenotype van de LECS-server binnen de lever. Met de ontdekking van de markeringen die zijn gevonden voornamelijk op de LECS-server3, vult het belang van deze cellen binnen verschillende weefsel niches in de homeostase en ziekte een belangrijke leemte in ons begrip. LECS-server hebben een belangrijke rol bij het handhaven van perifere tolerantie in de lymfeklier en gemetastaseerde tumoren door direct interactief werken met T cellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in de lymfeklier protectieve immuniteit via hun interacties met15,16van de14,van de trekkende dendritische cellen kunnen bevorderen. Daarom zijn er meerdere functies voor LECs die specifiek zijn voor de weefsels en interacties waarin ze aanwezig zijn. Maar is weinig begrepen over hoe de LECS-server interactie met immune cellen in het weefsel of hoe LECs functioneren in verschillende orgaansystemen; Dus, LECs evalueren op basis van per cel binnen de lever of andere organen kan leiden tot vooruitgang in hoe LECs program weefsel-specifieke immuniteit. Terwijl veel van de literatuur die zich op de LECS-server in de lever richt microscopie gebruikt om te visualiseren LECS-server met behulp van één of twee markeringen en morfologie17, is heel weinig gedaan om de LECS-server specifiek te evalueren op basis van cel voor cel met behulp van stroom cytometry, hoewel een studie verschillen tussen sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSECs) en LECs18evalueren. Kunnend analyseren LEC populaties in de lever door stroom cytometry voorziet de grondige studie van LEC fenotype tijdens normale homeostase of ziekte.
Om te beoordelen LECs door stroom cytometry, zijn meerdere oppervlakte markeringen nodig. Typisch, LECs worden gevisualiseerd door de expressie van prospero-gerelateerde homeobox 1 (Prox-1), de lymfatische vaartuig endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) of de vasculaire endotheliale groeifactor receptor 3 (VEGFR3) met behulp van microscopie. In de lever is de uitdrukking van deze markers echter niet beperkt tot de LECS-server. ProX-1 is wijd van hepatocyten tijdens lever ontwikkeling, regeneratie en letsel19, en LYVE1 en VEGFR3 worden geuit door de endotheliale cellen van de lever sinusvormige18. In de lymfeklier, LECs worden geïdentificeerd met behulp van stroom cytometry als clusters van differentiatie (CD) CD45 – CD31 + en podoplanin + (PDPN)16. Deze aanpak is echter ook minimale LECs in de lever te isoleren omdat CD45 – CD31 + cellen endotheliale cellen vangen zal, en de overheersende bevolking van vasculaire endotheliale cellen in de lever LSECs zijn. Zo nodig andere markeringen zijn te onderscheiden van de zeldzame LEC-bevolking uit de overvloedige LSEC populatie. Zowel CD16/32 (uitgedrukt door volwassen LSECs18) en CD146 (een gemeenschappelijke vasculaire endothelial cel markering die wordt hoofdzakelijk binnen de lever sinusoïdes uitgedrukt door endotheliale cellen van de lever sinusvormige20 met weinig tot geen expressie door lymfatisch endotheliale cellen21) werden kandidaat-markeringen.
Daarom geoptimaliseerd we een methode voor het opsporen en visualiseren van de LECS-server in de lever met behulp van de bovenstaande markeringen, CD45, CD31, CD146, CD16/32 en PDPN voor stroom cytometry. We beschrijven het gebruik van collagenase IV, DNase 1 en mechanische scheiding voor leverweefsel vertering in de schorsing van een eencellige. Ook beschrijven we het gebruik van iodixanol dichtheid verloop voor de isolatie van niet-parenchymal cellen (NPC) en te elimineren cellulaire puin. Ten slotte, met behulp van meerdere markeringen, we de optimale stroom cytometry gating strategie te identificeren van de LECS-server van de lever met PDPN als overheersende markering bepalen.
Het algemene belang van LECs in immuun homeostase en verordening gekomen onlangs tot lichte25. Veel van de gepubliceerde lymfatische literatuur focust op de huid en lymfklieren; echter, lymfatische worden aangetroffen in het lichaam26 , en dus ons begrip van hun belang in verschillende organen nodig is. Hier laten we een methode waarin de LECS-server in de lever kunnen worden bestudeerd op basis van cel-door-cel om hun gelijktijdige uitdrukking van verschillende oppervlakte…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank de GI en lever aangeboren immuun programma’s voor monetaire steun voor dit project. B.A.J.T. wordt ook gefinancierd door R01 AI121209.
Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
Scalpel | Feather | 2975#21 | |
100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
96 well plate | Corning | 3788 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
50 ml conical | Truline | TR2004 | |
15 ml conical | Falcon | 352196 | |
1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |