Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.
Karaciğer içinde lenf damarları portal Triad’ın içinde bulunan ve açıklanan işlevlerine interstisyel sıvı karaciğer lenf düğümlerine nerede hücresel artıkları ve antijenleri ankete kaldırmaktır. Nasıl lenfatik damarlara inflamasyon ve bağışıklık hücre fonksiyon içinde karaciğer dahil anlamakta çok ilgileniyoruz. Ancak, çok az sindirim karaciğer veya karaciğer değerlendirmek için kullanılan belirli işaretleri lenfatik endotel hücrelerinin (LECs) yalıtım için protokollerin oluşturulması yayımlanmış LECs hücre başına temelinde. Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş sindirim ve karaciğer karaciğer LEC nüfus değerlendirmek için boyama için bir yöntem. Biz burada özetlenen yöntemi kimlik ve karaciğer LECs, izolasyon için yararlı olacak ve bizim anlayış nasıl yanıt LECs karaciğer microenvironment güçlendirecek eminiz.
Lenf damarları ve LECs rolünü karaciğerde de anlaşılmış değildir. Olsa da lenf damarları karaciğer1 portal üçlü içinde bulunur ve hastalık2sırasında genişletin, çok az işlev ve LECs fenotip içinde karaciğer ile ilgili anlaşılmaktadır. Üzerinde öncelikle3LECs bulunur işaretleri keşfi ile bu hücrelerin farklı doku nişler homeostazı ve hastalık içinde önemini anlayışımızın önemli bir boşluğu dolduracaktır. LECs doğrudan T hücreleri4,5,6,7,8ile, etkileşerek periferik tolerans lenf nodu ve metastatik tümörler korumada önemli bir rol var 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs lenf düğümünde koruyucu bağışıklığı göçmen dendritik hücreler14,15,16ile onların etkileşim yoluyla teşvik. Bu nedenle, doku ve etkileşimleri mevcut oldukları için belirli olabilir LECs için birden çok rol vardır. Ancak, çok az doku bağışıklık hücreleri nasıl LECs etkileşim veya nasıl farklı organ sistemlerinde LECs çalışması hakkında anlaşılmaktadır; Böylece, LECs karaciğer veya diğer organlara içinde hücre başına bazında değerlendirilmesi nasıl LECs doku özgü bağışıklık programı gelişmeler yol açabilir. Karaciğerde LECs üzerinde duruluyor edebiyat çoğunu LECs bir ya da iki işaretleri ve morfoloji17kullanarak görselleştirmek için mikroskobu kullanırken, çok az özellikle LECs akış sitometresi, yine de bir çalışmada kullanılarak hücre hücre için ayrı ayrı değerlendirmek için yapılmıştır karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri (LSECs) ve LECs18arasındaki farklılıkları değerlendirmek. LEC nüfus karaciğerde akış sitometresi tarafından analiz edememek LEC fenotip derinlemesine çalışma için normal homeostazı veya hastalık sırasında sağlar.
LECs tarafından akış sitometresi değerlendirmek için birden fazla yüzey işaretleyicileri ihtiyaç vardır. Genellikle, LECs ifade prospero ile ilgili homeobox 1 (Prox-1), lenf damarı endotel hyaluronan reseptör 1 (LYVE1) veya vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör 3 (VEGFR3) mikroskopi kullanarak tarafından görüntülenmiştir. Ancak, karaciğerde, bu işaretleri ifade LECs için sınırlı değildir. Prox-1 yaygın tarafından hepatosit karaciğer geliştirme, yenilenme ve yaralanma19sırasında ifade edilir ve LYVE1 ve VEGFR3 karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri18tarafından ifade edilir. Lenf düğümünde, LECs akış sitometresi farklılaşma (CD) kümeleri kullanılarak tanımlanır CD45-, CD31 + ve podoplanin + (PDPN)16. Ancak, bu yaklaşım LECs karaciğerde CD45 – CD31 + hücreler endotel hücreleri ele geçirecek, ve vasküler endotel hücreleri karaciğer baskın nüfusu LSECs yana yalıtmak için de en az düzeydedir. Böylece, diğer işaretleri bol LSEC nüfus nadir LEC popülasyondan ayırt etmek için ihtiyaç vardır. CD16/32 (olgun LSECs18tarafından ifade edilir) ve CD146 (içinde karaciğer sinusoids karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri20 az lenfatik tarafından herhangi bir ifade ile ifade edilen ağırlıklı olan bir ortak vasküler endotel hücre işaretçisi endotel hücreleri21) aday işaretleri vardı.
Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş izole edip yukarıdaki işaretleri, CD45, CD31, CD146, CD16/32 PDPN akış sitometresi için kullanma ve karaciğerde LECs görüntülenmesi için bir yöntem. Biz collagenase IV kullanımı, DNaz 1 ve karaciğer dokusu sindirim içine bir tek hücre süspansiyon için mekanik ayırma açıklar. Biz de iodixanol yoğunluk gradient yalıtım parenkima hücre (NPC) ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, birden çok işaretçileri kullanarak, LECs ile PDPN baskın marker olarak karaciğer tanımlamak için en uygun akış sitometresi gating strateji belirleriz.
LECs genel önem bağışıklık homeostazı ve düzenleme son zamanlarda hafif25için geldi. Yayımlanmış lenfatik edebiyatının çok fazla deri ve lenf düğümlerinde odaklanmaktadır; Ancak, Lenfleribile vücut26 bulunur ve bu nedenle anlayışımız farklı organlarda önem sırasında gereklidir. İşte hücre hücre olarak aynı anda onların ifade farklı yüzey işaretleyicileri, sitokinler, kemokinler ve transkripsiyon faktörleri gibi hücre içi proteinler da…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar GI ve karaciğer doğuştan gelen bağışıklık programları bu projenin parasal destek için teşekkür etmek istiyorum. B.A.J.T. da R01 AI121209 tarafından finanse edilmektedir.
Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
Scalpel | Feather | 2975#21 | |
100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
96 well plate | Corning | 3788 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
50 ml conical | Truline | TR2004 | |
15 ml conical | Falcon | 352196 | |
1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |