Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques
Summary
Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.
Abstract
Dans le foie, les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte et leur fonction décrite consiste à éliminer le liquide interstitiel du foie vers les ganglions lymphatiques où les débris cellulaires et les antigènes peuvent être interrogés. Nous sommes très désireux de comprendre comment le système vasculaire lymphatique peut-être être impliqué dans l’inflammation et la fonction des cellules immunitaires dans le foie. Cependant, très peu a été publié d’établir des protocoles de digestion pour l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques (ESL) du foie ou des marqueurs spécifiques qui peuvent servir à évaluer le foie ESL sur une base par cellule. Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour la digestion et du foie de coloration afin d’évaluer la population de l’ESL dans le foie. Nous sommes convaincus que la méthode décrite ici vous sera utile pour l’identification et l’isolement des ESL le foie et permettra de renforcer notre compréhension de comment ESL répondent au microenvironnement du foie.
Introduction
Le rôle des vaisseaux lymphatiques et les ESL dans le foie n’est pas bien compris. Alors que les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte du foie1 et augmentent au cours de la maladie2, très peu est entendu au sujet de la fonction et du phénotype des ESL dans le foie. Avec la découverte de marqueurs que l’on trouve principalement sur ESL3, l’importance de ces cellules à l’intérieur des niches de différents tissus dans l’homéostasie et la maladie comblera une lacune importante dans notre compréhension. ESL ont un rôle majeur dans le maintien de la tolérance périphérique dans le ganglion lymphatique et dans des tumeurs métastatiques en interagissant directement avec les cellules des T4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ESL dans le ganglion lymphatique peut favoriser l’immunité protectrice par l’intermédiaire de leurs interactions avec les cellules dendritiques migrateurs14,15,16. Par conséquent, il y a des rôles multiples pour les ESL qui peut-être être spécifiques à des tissus et des interactions dans lesquelles ils sont présents. Toutefois, très peu est comprise sur ESL l’interaction avec les cellules immunitaires dans les tissus ou le fonctionnement des ESL dans différents organes ; ainsi, évaluer ESL sur une base par cellule dans le foie ou d’autres organes peut-être entraîner avances dans comment ESL programmer l’immunité tissulaire spécifique. Alors qu’une grande partie de la littérature qui se concentre sur l’ESL dans le foie utilise la microscopie pour visualiser les ESL à l’aide d’un ou deux marqueurs et morphologie17, très peu a été fait afin d’évaluer plus précisément ESL sur une base de la cellule par cellule à l’aide de cytométrie en flux, si une étude a fait évaluer les différences entre cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) et ESL18. Être capable d’analyser les populations ESL dans le foie par cytométrie en flux permet l’étude approfondie du phénotype LEC pendant homéostasie normale ou d’une maladie.
Evaluer ESL par cytométrie en flux, plusieurs marqueurs de surface sont nécessaires. En général, ESL sont visualisées par l’expression de prospero liés boîte homéotique 1 (Prox-1), le récepteur acide hyaluronique endothéliale de vaisseau lymphatique 1 (LYVE1) ou le récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR3) à l’aide de la microscopie. Toutefois, dans le foie, l’expression de ces marqueurs n’est pas limitée aux ESL. Prox-1 est largement exprimée par les hépatocytes pendant le développement du foie, régénération et blessures19, et LYVE1 et VEGFR3 sont exprimés par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques18. Dans le ganglion lymphatique, ESL sont identifiés comme des grappes de différenciation (CD) à l’aide de cytométrie CD45, CD31 + et podoplanin + (PDPN)16. Cependant, cette approche est trop minime pour isoler les ESL dans le foie comme cellules CD45 – CD31 + capturera les cellules endothéliales, et la population prédominante des cellules endothéliales vasculaires dans le foie est LSECs. Ainsi, les autres marqueurs sont nécessaires pour distinguer la population ESL rare de la population de LSEC abondante. CD16/32 (exprimées par mature LSECs18) et CD146 (un cellule endothéliale vasculaire marqueur commun qui est principalement exprimé dans les sinusoïdes du foie par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques20 avec peu ou aucune expression de lymphatique les cellules endothéliales21) ont été les marqueurs candidats.
Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour isoler et visualisation des ESL dans le foie aide ci-dessus marqueurs, CD45, CD31, CD146, CD16/32 et PDPN pour la cytométrie en flux. Nous décrivons l’utilisation de collagénase IV, DNase 1 et séparation mécanique pour la digestion du tissu hépatique en une suspension de cellules individuelles. Nous décrivons également l’utilisation de gradient de densité d’iodixanol pour l’isolement de cellules non parenchymateuses (NPC) et d’éliminer les débris cellulaires. Enfin, à l’aide de plusieurs marqueurs, nous déterminons la stratégie de blocage de cytométrie en flux flux optimal pour identifier des ESL du foie avec PDPN comme marqueur prédominant.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’importance des ESL dans l’homéostasie du système immunitaire et la régulation est récemment venu à lumière25. Une grande partie de la littérature publiée lymphatique se concentre sur la peau et les ganglions lymphatiques ; Cependant, vaisseaux lymphatiques sont trouvent partout dans le corps26 et, par conséquent, notre compréhension de leur importance dans les différents organes est nécessaire. Nous montrons ici une méthode dans laquelle les ESL dans le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier les GI et les programmes système immunitaire innée de foie pour un soutien financier de ce projet. B.A.J.T. est également financé par R01 AI121209.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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