Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber¹ und Krankheit²auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs³gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierten Tumoren durch die Interaktion direkt mit T Zellen^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs in den Lymphknoten können schützende Immunität über ihre Interaktionen mit wandernden dendritischen Zellen^14,15,16fördern. Daher gibt es mehrere Rollen für LECs möglicherweise spezifisch für die Gewebe und Interaktionen, in denen sie vertreten sind. Jedoch sehr wenig verstanden wie LECs mit Immunzellen im Gewebe interagieren oder LECs in verschiedenen Organsystemen Funktionsweise; so kann die Bewertung LECs auf einer Basis pro Zelle innerhalb der Leber oder andere Organe zu Fortschritte in der wie LECs Gewebe-spezifische Immunität Programm führen. Während ein Großteil der Literatur, die in der Leber auf LECs konzentriert Mikroskopie nutzt, um mit ein oder zwei Markierungen und Morphologie¹⁷LECs zu visualisieren, wurde sehr wenig getan, um speziell LECs anhand einer Zelle für Zelle Durchflusszytometrie, obwohl eine Studie bewerten Unterschiede zwischen sinusförmigen endothelial Zellen der Leber (LSECs) und LECs¹⁸bewerten. Möglichkeit, LEC Populationen in der Leber durch Durchflusszytometrie analysieren können für die eingehende Untersuchung der LEC Phänotyp bei normalen Homöostase oder Krankheit.

Um LECs durch Durchflusszytometrie zu bewerten, werden mehrere Oberflächenmarker benötigt. In der Regel sind LECs durch den Ausdruck von Prospero-bezogene Homeobox 1 (Prox-1), Lymphgefäßsystem endotheliale Hyaluronan Rezeptor 1 (LYVE1) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor Rezeptor 3 (VEGFR3) mit Mikroskopie visualisiert. Jedoch ist der Ausdruck dieser Marker in der Leber nicht auf LECs beschränkt. Prox-1 drückt sich häufig durch Hepatozyten während Leber Entwicklung, Regeneration und Verletzungen¹⁹, und LYVE1 und VEGFR3 durch die Leber sinusförmigen Endothelzellen¹⁸ausgedrückt werden. In den Lymphknoten werden LECs durch Durchflusszytometrie als Cluster der Differenzierung (CD) identifiziert CD45 – CD31 + und Podoplanin + (PDPN)¹⁶. Dieser Ansatz ist jedoch zu gering, LECs in der Leber zu isolieren, da CD45 – CD31 + Zellen werden Endothelzellen zu erfassen, und die überwiegende Bevölkerung von vaskulären endothelialen Zellen in der Leber LSECs sind. Daher sind andere Markierungen erforderlich, um die seltenen LEC Bevölkerung aus der reichlich LSEC Bevölkerung zu unterscheiden. CD16/32 (ausgedrückt durch ausgereifte LSECs¹⁸) und CD146 (eine gemeinsame vaskulären Endothelzellen Symbol, das sich überwiegend innerhalb der Leber Sinusoide geäußerten Leber sinusförmigen Endothelzellen²⁰ mit wenig bis kein Ausdruck von lymphatischen Endothelzellen²¹) wurden Kandidaten Marker.

Daher haben wir eine Methode zur Isolierung und Visualisierung LECs in der Leber, die mit den oben genannten Markierungen, CD45 CD31, CD146, CD16/32 und PDPN für Durchflusszytometrie optimiert. Wir beschreiben die Verwendung von Kollagenase IV, DNase 1 und mechanische Trenntechnik für Lebergewebe Verdauung in eine einzelne Zelle-Suspension. Wir beschreiben auch die Verwendung des Iodixanol Dichtegradient für die Isolierung von nicht-parenchymal Zellen (NPC) und Zelltrümmer zu beseitigen. Zu guter Letzt ermitteln mit mehreren Markern, wir die optimalen Fluss Cytometry gating Strategie LECs aus der Leber mit PDPN als die vorherrschende Marker zu identifizieren.