העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.
Abstract
בתוך הכבד, כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים פורטל, תפקידם המתואר הוא להסיר את נוזל בין-תאי הכבד אל קשרי הלימפה איפה להיות סקר פסולת הסלולר ו אנטיגנים. . אנחנו מאוד מעוניינים להבין כיצד להערכת הלימפה מעורבים דלקת ותפקוד תא החיסון בתוך הכבד. עם זאת, מעט מאוד שפורסם הקמת מערכת העיכול פרוטוקולים עבור בידודו של תאי אנדותל הלימפה (LECs) של הכבד או סמני ספציפי יכול לשמש כדי להעריך את הכבד LECs על בסיס לכל תא. לכן, אנחנו אופטימיזציה לפעולת העיכול, מכתים של הכבד על מנת להעריך את האוכלוסייה לץ בכבד. אנו בטוחים כי השיטה שמפורטות כאן יהיה שימושי עבור זיהוי ובידוד של LECs מן הכבד, תחזק את ההבנה שלנו של איך LECs להגיב microenvironment הכבד.
Introduction
התפקיד של כלי הלימפה LECs בכבד אינה מובנת היטב. בעוד כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים הפורטל של הכבד1 ולהתרחב במהלך המחלה2, מעט מאוד מובנת לגבי תפקוד ו פנוטיפ של LECs בתוך הכבד. עם גילוי סמנים הנמצאים בעיקר על LECs3, ימלא החשיבות של תאים אלה בתוך גומחות רקמות שונות בהומאוסטזיס ומחלות פער משמעותי בהבנה שלנו. LECs יש תפקיד מרכזי בשמירה על סובלנות היקפיים הצומת לימפה, גידולים גרורות באמצעות אינטראקציה ישירה עם T תאים4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs הצומת לימפה יכול לקדם חיסון הגנתי דרך האינטראקציות שלהם עם נדידת תאים דנדריטים14,15,16. לכן, ישנם תפקידים מרובים LECs אשר עשויים להיות ספציפיים ברקמות ואינטראקציות שבו הם נמצאים. עם זאת, מעט מאוד מובנת על איך LECs אינטראקציה עם תאים חיסוניים בתוך הרקמה או איך LECs פועלים מערכות איברים שונים; לפיכך, הערכת LECs על בסיס לכל תא בתוך הכבד או איברים אחרים עשויים להוביל ההתקדמות איך LECs תוכנית חסינות רקמות ספציפיות. אף רוב הספרים המתמקד LECs בכבד מיקרוסקופ כדי להמחיש LECs שימוש אחד או שני סמנים ומורפולוגיה17, מעט מאוד נעשה להעריך באופן ספציפי LECs על בסיס תא על-ידי התא באמצעות cytometry זרימה, מחקר אחד בכל זאת להעריך את ההבדלים בין תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSECs) LECs18. היכולת לנתח לץ אוכלוסיות בכבד על ידי cytometry זרימה מאפשר מחקר מעמיק של פנוטיפ לץ במהלך הומאוסטזיס נורמלי או מחלה.
כדי להעריך את LECs על ידי cytometry זרימה, נדרשים מספר סמני פני השטח. בדרך כלל, LECs הם דמיינו ידי הביטוי של גנים homeobox הקשורות פרוספרו 1 (Prox-1), קולטן חומצה היאלורונית אנדותל כלי הלימפה 1 (LYVE1) או צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 3 (VEGFR3) באמצעות מיקרוסקופ. עם זאת, בכבד, הביטוי של סמנים אלה אינה מוגבלת LECs. Prox-1 מבוטא באופן נרחב על-ידי hepatocytes במהלך פיתוח בכבד, התחדשות, פציעה19, LYVE1 ו- VEGFR3 באים לידי ביטוי על ידי תאי אנדותל כבד sinusoidal18. הצומת לימפה, LECs מזוהים באמצעות cytometry זרימה כמו אשכולות של בידול (CD) CD45 – CD31 +, podoplanin + (PDPN)16. עם זאת, גישה זו היא יותר מידי מינימלית כדי לבודד LECs בכבד מאז CD45 – CD31 + תאים ללכוד תאי אנדותל, האוכלוסייה הדומיננטית של תאי אנדותל כלי הדם בכבד הם LSECs. לפיכך, סמנים אחרים נדרשים כדי להבחין בין האוכלוסייה לץ נדיר מהאוכלוסייה LSEC שופע. CD16/32 (לידי ביטוי LSECs בוגר18) והן CD146 (נפוץ תא אנדותל כלי הדם סמן זה יוכפל לאחר המרתו לידי בתוך sinusoids הכבד תאי אנדותל sinusoidal הכבד20 עם מעט שום הבעה על ידי הלימפה תאי אנדותל21) היו הסמנים המועמד.
לכן, אנחנו אופטימיזציה שיטה אנליטית והצגה של LECs בכבד באמצעות את לעיל סמנים CD45, CD31, CD146, CD16/32, PDPN עבור cytometry זרימה. אנו מתארים את השימוש collagenase הרביעי DNase 1, ההפרדה המכני לעיכול רקמת הכבד להשעיה תא בודד. אנו מתארים גם את השימוש iodixanol דחיסות צבע עבור הבידוד של תאים שאינם parenchymal (NPC), כדי לסלק פסולת הסלולר. לבסוף, באמצעות מספר סמני, נוכל לקבוע האסטרטגיה המגביל ביותר cytometry זרימה אופטימלית לזהות LECs מן הכבד עם PDPN כמו דה מרקר הדומיננטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
החשיבות הכללית של LECs הומאוסטזיס המערכת החיסונית, רגולציה לאחרונה הובא אור25. רוב הספרים שפורסמו הלימפה מתמקד העור ואת בלוטות הלימפה; עם זאת, lymphatics פזורים ברחבי הגוף26 ו, לכן, נדרש הבנתנו את החשיבות של איברים שונים. הנה אנחנו מראים שיטה שבה ניתן יהיה ללמוד LECs בכבד על ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות GI של תוכניות החיסון מולדים בכבד לתמיכה כספית של פרויקט זה. B.A.J.T. גם ממומן על ידי R01 AI121209.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).
