Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

No se comprende bien el papel de los vasos linfáticos y LECs en el hígado. Mientras que los vasos linfáticos se encuentran dentro de la tríada portal del hígado¹ y durante la enfermedad², muy poco se entiende sobre la función y el fenotipo de LECs dentro del hígado. Con el descubrimiento de marcadores que se encuentran principalmente en el LECs³, la importancia de estas células dentro de nichos de diferentes tejidos en homeostasis y enfermedad llenará un vacío importante en nuestro entendimiento. LECs tienen un papel importante en mantener la tolerancia periférica en los ganglios linfáticos y en los tumores metastáticos interactuando directamente con T las células^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs en los ganglios linfáticos pueden promover inmunidad protectora a través de sus interacciones con las células dendríticas migratorias^14,15,16. Por lo tanto, hay múltiples funciones de LECs que pueden ser específicos de los tejidos y las interacciones en que están presentes. Sin embargo, muy poco se entiende sobre cómo interactúan con las células inmunes en el tejido los LECs o funcionan de LECs en diferentes órganos; por lo tanto, evaluar LECs en una base por células en el hígado u otros órganos puede conducir a avances en cómo LECs programa inmunidad específica de tejido. Mientras que mucha de la literatura que se centra en el LECs en el hígado utiliza la microscopia visualizar LECs con uno o dos marcadores y morfología¹⁷, muy poco se ha hecho para evaluar específicamente LECs en una base de la célula por célula mediante citometría de flujo, aunque un estudio evaluar las diferencias entre las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) y LECs¹⁸. Poder analizar las poblaciones de la LEC en el hígado mediante citometría de flujo permite el estudio en profundidad del fenotipo de la LEC durante la homeostasis normal o enfermedad.

Para evaluar el LECs por citometría de flujo, se necesitan múltiples marcadores de superficie. Por lo general, LECs son visualizados por la expresión de homeobox relacionado con prospero 1 (Prox 1), receptor del recipiente linfático hyaluronan endotelial 1 (LYVE1) o factor de crecimiento endotelial vascular del receptor 3 (VEGFR3) mediante microscopía. Sin embargo, en el hígado, la expresión de estos marcadores no se limita a LECs. Prox-1 se expresa ampliamente por los hepatocitos durante el desarrollo del hígado, regeneración y lesiones¹⁹, y LYVE1 y VEGFR3 son expresados por las células endoteliales sinusoidales del hígado¹⁸. En los ganglios linfáticos, el LECs se identifican mediante citometría de flujo como racimos de diferenciación (CD) CD45 – CD31 + y podoplanin + (PDPN)¹⁶. Sin embargo, este enfoque es también mínimo para aislar LECs en el hígado, ya que las células CD45 – CD31 + capturará las células endoteliales, y la población predominante de las células endoteliales vasculares en el hígado es LSECs. Así, se necesitan otros marcadores para distinguir la rara población de LEC de la abundante población de LSEC. CD16/32 (expresado por maduros LSECs¹⁸) y CD146 (un célula endotelial vascular marcador común que es predominantemente expresada dentro de los sinusoides del hígado por las células endoteliales sinusoidales del hígado²⁰ con poca o ninguna expresión por linfático las células endoteliales²¹) fueron marcadores de candidato.

Por lo tanto, hemos optimizado un método para aislar y visualizar LECs en el hígado utilizando los anteriores marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 y PDPN para citometría de flujo. Describimos el uso de colagenasa IV, DNasa 1 y separación mecánica para la digestión del tejido del hígado en una suspensión unicelular. También describimos el uso de iodixanol gradiente de densidad para el aislamiento de células no parenquimatosas (NPC) y para eliminar desechos celulares. Por último, uso de marcadores múltiples, determinar la estrategia bloquea de citometría de flujo óptimo para identificar LECs del hígado con PDPN como el marcador predominante.