Summary

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

والهدف من هذا البروتوكول تحديد الخلية اللمفاوية غشائي السكان داخل الكبد باستخدام علامات وصف. فنحن نستخدم كولاجيناز الرابع والدناز وتنميق رقيقة من الأنسجة، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، لتحديد عدد سكانها متميزة من خلايا بطانية اللمفاوية.

Abstract

داخل الكبد، والأوعية اللمفاوية توجد داخل الثالوث المدخل، ووظيفتها وصف لإزالة السائل الخلالي من الكبد إلى الغدد الليمفاوية حيث يمكن مسح الحطام الخلوية ومولدات المضادات. ونحن مهتمون للغاية في فهم كيف يمكن أن تشترك المفرج اللمفاوي في التهاب ووظيفة الخلايا المناعية داخل الكبد. إلا أن القليل جداً قد تم نشر وضع بروتوكولات الهضم لعزل خلايا بطانية اللمفاوي (LECs) من الكبد أو علامات محددة التي يمكن استخدامها لتقييم الكبد لاو على أساس كل خلية. ولذلك، نحن الأمثل وسيلة الهضم وتلطيخ الكبد بغية تقييم السكان LEC في الكبد. ونحن واثقون من أن الطريقة المبينة هنا ستكون مفيدة لتحديد وعزل لاو عن الكبد، وسيتم تعزيز فهمنا لكيفية التجاوب لاو المكروية الكبد.

Introduction

دور الأوعية اللمفاوية ولاو في الكبد ليست مفهومة جيدا. بينما توجد داخل الثالوث المدخل من الكبد1 الأوعية اللمفاوية وتوسيع أثناء المرض2، سوى القليل جداً من المفهوم فيما يتعلق بوظيفة والنمط الظاهري للموظفين المدنيين المحليين داخل الكبد. مع اكتشاف علامات موجودة أساسا في لاو3، أهمية هذه الخلايا داخل المنافذ أنسجة مختلفة في التوازن والمرض سوف تملأ فجوة كبيرة في فهمنا. لاو بدور رئيسي في الحفاظ على التسامح المحيطية في العقدة الليمفاوية وأورام المنتشر بالتفاعل مباشرة مع تي الخلايا4،،من56،،من78، 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يمكن تعزيز لاو في العقدة الليمفاوية حصانة وقائية عن طريق تفاعلها مع الخلايا الجذعية المهاجرة14،،من1516. ولذلك، هناك أدوار متعددة للأو التي قد تكون محددة للأنسجة والتفاعلات التي يتواجدون فيها. ومع ذلك، سوى القليل جداً من المفهوم حول كيفية تفاعل لاو مع الخلايا المناعية في الأنسجة أو الكيفية التي تعمل بها لاو في أنظمة الجهاز المختلفة؛ وهكذا، تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس كل خلية داخل الكبد أو الأجهزة الأخرى قد يؤدي إلى التقدم في كيفية برنامج لاو الحصانة الخاصة بالانسجة. بينما الكثير من المؤلفات التي تركز على LECs في الكبد يستخدم الفحص المجهري لتصور لاو استخدام واحد أو اثنين من علامات ومورفولوجيا17، أنجز القليل جداً على وجه التحديد تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية باستخدام التدفق الخلوي، على الرغم من أن إحدى الدراسات تقييم الاختلافات بين خلايا الكبد بطانية جيبية () ولاو18. التمكن من تحليل السكان LEC في الكبد من خلال التدفق الخلوي يسمح للدراسة المتعمقة للنمط الظاهري LEC أثناء التوازن الطبيعي أو المرض.

هناك حاجة لتقييم الموظفين المدنيين المحليين عن طريق التدفق الخلوي، عدة علامات السطحية. عادة، يتم تصور لاو بالتعبير عن ذات الصلة بروسبيرو هوميوبوكس 1 (Prox-1) أو السفينة اللمفاوية hyaluronan بطانية مستقبلات 1 (LYVE1) أو مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية 3 (VEGFR3) باستخدام الفحص المجهري. ومع ذلك، في الكبد، والتعبير عن هذه العلامات غير مقيد إلى لاو. وأعرب Prox-1 هو على نطاق واسع بخلايا الكبد خلال التنمية الكبد والتجدد، وإصابة19والتعبير عن LYVE1 و VEGFR3 ب الكبد خلايا بطانية جيبية18. في العقدة الليمفاوية، حددت لاو استخدام التدفق الخلوي كمجموعات من التمايز (CD) CD45-و CD31 + وبودوبلانين + (بدبن)16. بيد أن هذا النهج ضئيل جداً لعزل لاو في الكبد منذ CD45-CD31 + الخلايا سيتم التقاط خلايا بطانية, والسكان الغالبة للخلايا البطانية الوعائية في الكبد لسيكس. وهكذا، علامات أخرى ضرورية للتمييز بين السكان LEC نادرة من السكان لسيك وفيرة. CD16/32 (معبراً عنها بالنضج لسيكس18) و CD146 (مشترك خلايا بطانية وعائية علامة التي يغلب عليها الطابع أبداها الكبد خلايا بطانية جيبية20 مع قليل من لا تعبير اللمفاوية داخل الكبدية الكبد خلايا بطانية21) كانت علامات المرشح.

ولذلك، نحن الأمثل طريقة لعزل وتصور لاو في الكبد استخدام أعلاه علامات، CD45، CD31، CD146، CD16/32، وبدبن للتدفق الخلوي. يصف لنا استخدام كولاجيناز الرابع، 1 الدناز، وفصل الميكانيكية لهضم أنسجة الكبد في تعليق خلية واحدة. كما يصف لنا استخدام التدرج الكثافة إيوديكسانول لعزل الخلايا غير متني (المجلس الوطني) وإزالة الحطام الخلوية. وأخيراً، استخدام علامات متعددة، علينا أن نحدد استراتيجية النابضة الخلوي التدفق الأمثل لتحديد الموظفين المدنيين المحليين من الكبد مع بدبن كعلامة الغالبة.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا “رعاية الحيوان المؤسسية” واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كولورادو انشوتز حرم الجامعة الطبية. 1-إعداد المواد جعل حلاً 5 ملغ/مل من الدناز أنا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). جعل الخليط الهضم بإضافة 5,000 يو/مليلتر من كولاجيناز …

Representative Results

واستخدمت دراسات تحليل الكبد اللمفاوي أساسا إيمونوهيستوتشيميستري إلى كوانتيتاتي بالتردد وقطر الأوعية اللمفية في الكبد. ومع ذلك، لا يسمح هذا الأسلوب لتقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية أو للتعبير عن عدة علامات، السيتوكينات، المستقطبات، أو عوامل النسخ…

Discussion

عموما أهمية لاو في منأى عن التوازن والتنظيم أصبح مؤخرا الخفيفة25. الكثير من الكتابات المنشورة على اللمفاوية يركز على الجلد والعقد الليمفاوية؛ بيد أن اللمفاوي موجودة في جميع أنحاء الجسم26 وهكذا، هناك حاجة إلى فهمنا لأهميتها في مختلف الأجهزة. هنا نعرض طريقة التي يم?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر بمعهد جوته والكبد برامج المناعة الفطرية للدعم النقدي لهذا المشروع. كما يمول B.A.J.T. R01 AI121209.

Materials

Clicks/EHAA media Irvine Scientific 9195
Collagenase IV Worthington Biochemical corporation LS004188
DNase I Worthington Biochemical corporation LS002145 Deoxyribonuclease 1
OptiPrep Sigma Aldrich D1556 Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 BD biosciences 562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 Biolegend 134706 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) Biolegend 102420 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) Biolegend 127410 Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 Biolegend 103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) Biolegend 101306 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) Biolegend 101324 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye TONBO biosceinces 3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) Biolegened 402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) Biolegend 400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) ebioscience 1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) R&D systems FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) abcam ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) Bio-rad MCA497
BSA (fraction V) Fischer BP1600-100 Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
EDTA VWR E177 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride Fischer A687-500 for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate Fischer P184-500 for RBC Lysis buffer
Scalpel Feather 2975#21
100um cell strainer Fischer 22363549
2.4G2 in house/ATCC ATCC HB-197 FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta biologicals S11550
96 well plate Corning 3788
6 well plate Corning 3506
50 ml conical Truline TR2004
15 ml conical Falcon 352196
1 ml Pipete tip USA scientific 1111-2721
200 µl pipete tip USA scientific 1110-1700
10 µl pipete tip USA scientific 1111-3700
seriological 10ml pipete greiner bio-one 607107
seriological 5ml pipete greiner bio-one 606107
Cell incubator Fischer Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer BD biosciences
Clinical Centrifuge Beckman coulter model X-14R

References

  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).

Play Video

Cite This Article
Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).

View Video