Summary

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase と組み合わせてフローサイトメトリー、リンパ管内皮細胞の明瞭な人口を識別するために、組織の穏やかなミンチを駆使しています。

Abstract

肝臓内ポータル トライアド内リンパ管に発見されてし、記述されている機能はリンパ節、肝臓から間質液を削除する細胞残渣および抗原を調査することができます。リンパ血管が炎症や肝臓内の免疫細胞の機能に関与する方法を理解することに非常に興味を持っております。しかし、ほとんどはリンパ血管内皮細胞 (LECs) 肝臓や肝臓の評価に使用することができます特定のマーカーからの分離のための消化力のプロトコルを確立する公開されているセルごとに LECs。したがって、消化や肝臓で LEC の人口を評価するために、肝臓の染色法を最適化されています。ここで概説している方法を LECs の肝臓からの単離、同定に役立つ LECs が肝の微小環境に応答する方法の私達の理解を強化して確信しております。

Introduction

肝臓のリンパ管と LECs の役割はよくわかっていません。リンパ管肝1のポータル トライアド内にある病気の2の間に展開し、ほとんどは機能および肝臓内 LECs の表現型について理解されます。LECs3に主にあるマーカーの発見と恒常性と病気ニッチを異なる組織内でこれらの細胞の重要性は私達の理解の重要なギャップを埋めます。LECs は、T 細胞4,5,6,7,8と直接相互作用によってリンパ節、転移性腫瘍周辺の公差を維持する上で主要な役割を持っています。9,10,11,12,13。 リンパ節で LECs は、渡り鳥樹状細胞14,,1516との相互作用を介して防御免疫を促進できます。したがって、特定組織と相互作用が存在するかもしれない LECs に複数のロールがあります。ただし、非常に少しは LECs が組織の免疫細胞と対話する方法または LECs が異なる器官システムでどのように機能するかについて理解したがって、肝臓や他の臓器内のセルごとごとに LECs を評価 LECs プログラムの組織特異的免疫の進歩につながる可能性があります。肝臓で LECs に焦点を当てて文献の多くはマーカーと形態17の 1 つまたは 2 つ使用して LECs を可視化する顕微鏡を使用して、ほとんどはフローサイトメトリー、しかし 1 つの調査を使用してセルごとに LECs を具体的に評価に行われています。肝類洞内皮細胞 (LSECs) と LECs18の違いを評価しました。フローサイトメトリーによる肝臓のレック集団を分析できることで、LEC の表現型の詳細な研究通常恒常性や病気の時にことができます。

フローサイトメトリーによる LECs を評価するには、複数の表面マーカーが必要です。通常、LECs は、プロスペロー関連ホメオ ボックス 1 の式 (Prox-1)、リンパ管の内皮細胞のヒアルロン酸受容体 1 (LYVE1) または顕微鏡を用いた血管内皮細胞増殖因子受容体 3 (VEGFR3) によって視覚化されます。しかし、肝臓では、これらのマーカーの発現は LECs を制限されません。肝で肝開発、再生、および傷害19時近接 1 を広く表現し、LYVE1 と VEGFR3 は肝類洞内皮細胞18によって表されます。リンパ節で LECs は、分化 (CD) のクラスターとしてフローサイトメトリーを使用して識別されます CD45、CD31 +、ポドプラニン + (PDPN)16。しかし、このアプローチは CD45-CD31 陽性細胞は、血管内皮細胞をキャプチャし、肝臓の血管内皮細胞の優勢な人口が LSECs ので、肝臓で LECs を分離するも最小限。したがって、他のマーカーは、豊富な LSEC 人口からまれな LEC の人口を区別するために必要です。CD16/32 (成熟した LSECs18によって表される)、CD146 (一般的な血管内皮細胞マーカーは主に肝類洞内皮細胞20リンパでない式には少し肝洞様毛細血管内で表現内皮細胞21) 候補マーカーします。

したがって、我々 は分離とフローサイトメトリー用上記のマーカー、CD45、CD31、CD146、CD16/32、および PDPN を利用した肝臓内 LECs を可視化法を最適化されています。IV コラゲナーゼの使用、DNase 1 と単一細胞懸濁液に肝臓消化機械的分離について述べる。非実質細胞 (NPC) と細胞残屑を除去するために分離の iodixanol の密度勾配の使用についても述べる。最後に、複数のマーカーを使用して、我々 は優勢なマーカーとしての PDPN と肝臓から LECs を識別するために最適な流れ cytometry ゲーティング戦略を決定します。

Protocol

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスのによって承認されています。 1 材料の準備 DNase の 5 mg/mL の溶液を作るリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で。 IV コラゲナーゼの 5,000 U/mL をクリックしての EHAA メディアに追加することによって消化の混合物を作る。 ?…

Representative Results

研究は、肝臓のリンパ管を分析は主に周波数と肝臓のリンパ管の直径を量的に免疫組織化学を使用しています。ただし、セルごとに LECs の評価または複数のマーカー、サイトカイン、ケモカイン、または転写因子の発現のためには、このメソッドはできません。したがって、我々 は尋ねたかどうか肝 LECs 肝臓から分離することができるし、フローサイトメトリーを使…

Discussion

免疫恒常性と調節で LECs の全体的な重要性は、最近光25に来てください。発表されたリンパの文献の多くは皮膚やリンパ節に焦点を当ててください。しかし、リンパ管は26体で発見され、したがって、異なる臓器の重要性の理解が必要です。セルごとに異なる表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、および転写因子などの細胞内タンパク質の同時発現を…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、このプロジェクトの金融支援のため消化管と肝臓生得免疫プログラムを感謝したいです。B.A.J.T. も R01 AI121209 によって資金を供給します。

Materials

Clicks/EHAA media Irvine Scientific 9195
Collagenase IV Worthington Biochemical corporation LS004188
DNase I Worthington Biochemical corporation LS002145 Deoxyribonuclease 1
OptiPrep Sigma Aldrich D1556 Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 BD biosciences 562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 Biolegend 134706 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) Biolegend 102420 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) Biolegend 127410 Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 Biolegend 103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) Biolegend 101306 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) Biolegend 101324 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye TONBO biosceinces 3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) Biolegened 402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) Biolegend 400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) ebioscience 1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) R&D systems FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) abcam ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) Bio-rad MCA497
BSA (fraction V) Fischer BP1600-100 Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
EDTA VWR E177 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride Fischer A687-500 for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate Fischer P184-500 for RBC Lysis buffer
Scalpel Feather 2975#21
100um cell strainer Fischer 22363549
2.4G2 in house/ATCC ATCC HB-197 FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta biologicals S11550
96 well plate Corning 3788
6 well plate Corning 3506
50 ml conical Truline TR2004
15 ml conical Falcon 352196
1 ml Pipete tip USA scientific 1111-2721
200 µl pipete tip USA scientific 1110-1700
10 µl pipete tip USA scientific 1111-3700
seriological 10ml pipete greiner bio-one 607107
seriological 5ml pipete greiner bio-one 606107
Cell incubator Fischer Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer BD biosciences
Clinical Centrifuge Beckman coulter model X-14R

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Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).

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