Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

El desarrollo continuo de nuevas tecnologías de imagen y software con aplicaciones en las ciencias de la vida ha proporcionado un enorme impacto en la comprensión de los principios básicos de la vida. Uno de los principales desafíos es la visualización fiable de los procesos de desarrollo en combinación con sus imágenes en vivo en diversos tejidos. Los tejidos son partes de órganos y cuerpos y, como tales, la mayoría no son fácilmente accesibles para la toma de imágenes. Por lo tanto, se han desarrollado protocolos que permiten su disección y el cultivo in vitro con el fin de visualizar eventos biológicos que reflejan suficientemente la situación in vivo dentro de un cuerpo vivo.

Durante las últimas décadas, el cultivo y la toma de imágenes en vivo de las cámaras de óvulos Drosophila, estructuras similares a los acinares que se asemejan a órganos primitivos, ha contribuido inmensamente a la comprensión de los principios básicos del desarrollo primitivo de órganos^{1 , 2 , 3}. Actualmente, hay varios protocolos de cultivo disponibles, y su uso depende del tiempo de adquisición, el tipo de celda a la imagen y su accesibilidad (por ejemplo, línea germinal interna frente a línea somática externa)⁴.

Una característica común en todos estos protocolos de cultivo es la necesidad de la inmovilización de cámaras de huevo analizadas que muestran una alta actividad contráctea en medios líquidos. La actividad contráctea de las cámaras de huevo es causada principalmente por la hoja muscular que cubre una larga cadena de cámaras de huevo conectadas^5,6,7. Por lo tanto, para lograr la inmovilización adecuada de las cámaras de huevo joven, se han desarrollado varios enfoques, que implican cubrir las cámaras de huevo con cubretapas^6,8,9 o mantas flexibles^{4, 10} o incrustarlos en agarosa de punto bajo^3,11. Estos enfoques son populares, ya que también permiten la toma de imágenes de un plano visual más grande debido al aplanamiento sutil de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo.

Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que las cámaras de huevo joven (etapa 1-8) giran alrededor de su eje anterior-posterior⁶ y que este movimiento tisular es impulsado por una fina red de actomiosina cerca de la superficie circunferencial de estas cámaras ^{de huevo jóvenes 12}. Por lo tanto, la alteración artificial de la superficie celular causada por un aplanamiento sutil de este tejido puede tener un impacto negativo en el comportamiento de la maquinaria de actomiosina generadora de fuerza. El contrapunto es que si el tejido de la cámara de óvulos no se aplana, la imagen microscópica de proteínas en la superficie circunferencial de las cámaras de óvulos se vuelve aún más limitada por la disminución del tamaño del plano de adquisición.

Por lo tanto, hemos combinado protocolos de Prasad et al.⁹ y el laboratorio de Celeste Berg^4,10 y los hemos modificado para que no se utilice ninguna manta/agarosa flexible en el método desarrollado. Las cámaras de huevo drosofilia se cultivan libremente en los medios de comunicación y el protocolo que se presenta aquí sólo se aplica a la microscopía invertida. Hay dos partes en el protocolo. La primera parte se centra en el análisis de señales de actomiosina a escala celular local (hasta 15 células) dentro de las cámaras de óvulos. En la segunda parte, nos centramos en superar las limitaciones asociadas con un pequeño plano de adquisición causados por el cultivo libre de cámaras de huevo. En este sentido, hemos desarrollado un nuevo método computacional basado en Fiji con una interfaz gráfica de usuario semiinteractiva que extrae selectivamente y despliega capas definidas de una superficie de tejido circunferencial. Esto es seguido por un protocolo que describe cómo analizar la actomiosina a la escala tisular (es decir, >50 células). Como la extracción selectiva de una capa delgada definida de tejidos epitelialescurvos no ha sido fácilmente posible utilizando una proyección clásica de la pila z (Figura 1), este método fácil de usar sirve como un requisito previo importante para entender comportamiento de una red de actomiosina delgada (<1 m) a la escala tisular en las cámaras de óvulos de Drosophila.

Además, para facilitar el protocolo, proporcionamos películas de lapso de tiempo (TM) de ejemplo y archivos de muestra de comportamiento Myosin II convencional no muscular etiquetado fluorescentemente (consulte Archivo complementario 3). La miosina II es una proteína motora y representa la parte contrácta activa de la maquinaria actomiosina. Para la imagen de Myosin II, utilizamos líneas transgénicas Drosophila que contienen una cadena de luz reguladora modificada de Myosin II llamada MRLC::GFP (ver Tabla de Materiales para más detalles)^12,13. Para visualizar las membranas celulares, el protocolo se basa en destisos comerciales (ver Tabla de Materiales). Este protocolo es adecuado no sólo para el análisis de pequeñas señales subcelulares MRLC::GFP^12, sino también para cualquier partícula subcelular de tamaño similar alrededor de 300 m, como las observadas con Life-Act::GFP^12,14.

Aunque ambos protocolos se presentan utilizando cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, la adquisición de señales de actomiosina también se puede realizar utilizando otros tejidos tras la optimización de los medios de cultivo y dependiendo de la disponibilidad proteínas etiquetadas fluorescentes con los colorantes comerciales correspondientes o, por ejemplo, microinyecciones de ARNm para obtener perfiles transitorios de expresión génica. Del mismo modo, el protocolo basado en Fiji para la extracción de una capa delgada de una superficie circunferencial se puede aplicar de forma más general a tejidos elipsoides y similares a órganos.