培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

ライフサイエンス分野における新しいイメージング技術やソフトウェア技術の継続的な発展は、生命の基本原理を理解する上で大きなインパクトを与えています。主な課題の1つは、様々な組織におけるライブイメージングと組み合わせた発達プロセスの信頼性の高い可視化です。組織は臓器や身体の一部であり、そのため、大部分はイメージングに容易にアクセスできません。そこで、生体内の生体内の生体内状況を十分に反映する生物学的事象を可視化するために、解剖と体外培養を可能にするプロトコルが開発されている。

過去数十年にわたり、ショウジョウバエの卵室の培養とライブイメージング、原始臓器に似たアシナー様構造は、原始臓器開発の基本原理の理解に大きく貢献してきました1^,2,3.現在、利用可能ないくつかの培養プロトコルがあり、その使用法は、取得時間、画像化される細胞タイプ、およびそのアクセシビリティ(例えば、内生殖細胞系対外体線)4に依存する。

これらすべての培養プロトコルの共通の特徴は、液体媒体で高い収縮活性を示す分析された卵室の固定化の必要性である。卵室の収縮活性は、主に接続された卵室5、6、7の長い文字列をカバーする筋肉シートによって引き起こされる。したがって、若い卵室の適切な固定化を達成するために、様々なアプローチが開発され、カバースリップ6、8、9または柔軟な毛布4で卵室^を覆うことを含^{む、 10}または低融点アガロース3、11にそれらを埋め込む。これらのアプローチは、卵室の円周面の微妙な平坦化によるより大きな視覚面のイメージングも可能にするため、人気があります。

しかし、最近では、若い卵室(ステージ1-8)が前頭軸6の周りを回転し、この組織運動がこれらの若い卵室^{の周囲の表面に近い微細なアトミオシンネットワークによって動力を与えられることが示されている。12.}したがって、この組織の微妙な平坦化によって引き起こされる細胞表面の人工的な変化は、力を発生させるアミュミオシン機械の挙動に悪影響を及ぼす可能性がある。対抗点は、卵室組織が平坦化されない場合、卵室の周面におけるタンパク質の顕微鏡イメージングは、集録面のサイズの減少によってさらに制限される。

したがって、Prasad et al.⁹と Celeste Berg 4^,10のラボからプロトコルを組み合わせ、さらに改変して、開発された方法でカバースリップ/フレキシブル ブランケット/アガローズが使用されないようにしました。ショウジョウバエの卵室は、メディアで自由に培養され、ここで提示されるプロトコルは、反転顕微鏡のみを適用します。プロトコルには 2 つの部分があります。最初の部分は、卵室内の局所細胞スケール(最大15細胞)でのアトミオシンシグナルの分析に焦点を当てています。第2部では、卵室の自由な培養によって引き起こされる小さな集積面に関連する制限を克服することに焦点を当てます。この点に関して、我々は、円周組織表面の定義された層を選択的に抽出し、展開する半インタラクティブなグラフィカルユーザーインターフェイスを用いた新しいフィジーベースの計算方法を開発した。これに続いて、組織スケール(>50細胞)でアクトミオシンを分析する方法を説明するプロトコルが続きます。曲げられた上皮組織の定義された薄い層の選択的抽出は、古典的なZスタック投影(図1)を用いて容易に不可能であったので、この使いやすい方法は、包括的に理解するための重要な前提条件として機能する。ショウジョウバエ卵室の組織スケールにおける薄い(<1 μm)アミュニ発網の挙動。

さらに、プロトコルを容易にするために、我々は蛍光タグ付き非筋肉従来のミオシンII行動の例のタイムラプスムービー(TTLM)とサンプルファイルを提供する(補足ファイル3を参照)。ミオシンIIは、運動タンパク質であり、アクトミオシン機械の活性収縮部を表す。ミオシンIIを画像化するために、MRLC::GFPと呼ばれるミオシンIIの改変された調節性軽鎖を含むショウジョウバエトランスジェニックラインを使用しています(詳細は材料の表を参照)12,13.細胞膜を可視化するために、プロトコルは市販の染料に基づいています(材料の表を参照)。このプロトコルは、小さな細胞内MRLC::GFP^信号12の分析だけでなく、Life-Act::GFP12、14で観察されたものなど、±300 μMの周りの類似サイズの細胞粒子の分析にも適しています。

これらのプロトコルは両方ともインビトロ培養ショウジョウバ卵室を用いて提示されるが、培養培養培養媒体の最適化および可用性に応じて他の組織を用いてアトミオシンシグナルの獲得を行うこともできる。対応する市販染料を有する蛍光タグ付きタンパク質または、例えばmRNAマイクロインジェクションを用いて一過性遺伝子発現プロファイルを得る。同様に、周囲の表面から薄い層を抽出するためのフィジーベースのプロトコルは、より一般的に楕円体および器官様組織に適用することができる。