Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер
Summary
Этот протокол обеспечивает основанную на Фиджи, удобную методологию наряду с простыми инструкциями, объясняющие, как надежно анализировать поведение актомиозина в отдельных клетках и изогнутых эпителиальных тканях. Нет навыков программирования не требуется, чтобы следовать учебник; все шаги выполняются в полуинтерактивной манере с использованием графического пользовательского интерфейса Фиджи и связанных с ними плагинов.
Abstract
Дрозофилы незрелые яйца называются яичными камерами, и их структура напоминает примитивные органы, которые претерпевают морфологические изменения от круглой до эллипсоидной формы во время развития. Этот процесс развития называется oogenesis и имеет решающее значение для генерации функциональных зрелых яиц для обеспечения следующего поколения мух. По этим причинам яичные камеры служили идеальной и соответствующей моделью для понимания развития органов животных.
Было разработано несколько протоколов по культивированию in vitro, но в этих протоколах есть несколько недостатков. Один включает в себя применение различных охватывает, которые оказывают искусственное давление на изображения яичных камер для того, чтобы обездвижить их и увеличить изображение плоскости приобретения окружной поверхности проанализированных яичных камер. Такой подход может негативно повлиять на поведение тонкого актомиозина, который генерирует способность вращать яичные камеры вокруг своей более длинной оси.
Таким образом, чтобы преодолеть это ограничение, мы культуры Drosophila яичные камеры свободно в средствах массовой информации для того, чтобы надежно анализировать актомиозина машины вдоль окружности яичных камер. В первой части протокола мы предоставляем инструкцию с подробным описанием того, как анализировать актомиозиновое оборудование в ограниченной плоскости приобретения в локальном сотовом масштабе (до 15 ячеек). Во второй части протокола мы предоставляем пользователям новый плагин на основе Фиджи, который позволяет просто йодицию определенного тонкого слоя окружной поверхности яичных камер. Затем в следующем протоколе описывается, как анализировать сигналы актомиозина в масштабе ткани (Ят;50 клеток). Наконец, мы выявляем ограничения этих подходов как на локальном клеточном, так и в тканевом масштабе и обсуждаем его потенциальное будущее развитие и возможное применение.
Introduction
Постоянное развитие новых технологий визуализации и программного обеспечения с применением в науке о жизни оказало огромное влияние на понимание основных принципов жизни. Одной из основных задач является надежная визуализация процессов развития в сочетании с их живой визуализацией в различных тканях. Ткани являются частями органов и органов, и, как таковые, большинство из них не легко доступны для визуализации. Таким образом, протоколы, которые позволяют их вскрытия и in vitro культивирования были разработаны для того, чтобы визуализировать биологические события, которые достаточно отражают in vivo ситуации в живом теле.
За последние десятилетия культивирование и живое изображение яичных камер Дрозофилы, ацинар-подобных структур, напоминающих примитивные органы, внесло огромный вклад в понимание основных принципов развития примитивных органов1 , 2 , 3. В настоящее время существует несколько протоколов культивирования, и их использование зависит от времени приобретения, типа ячейки, подимеющейся на изображении, и их доступности (например, внутренней зародышевой линии против внешней соматической линии)4.
Общей чертой во всех этих протоколах культивирования является необходимость иммобилизации проанализированных яичных камер, которые отображают высокую сократительую активность в жидких носителях. Сократительная активность яичных камер вызвана главным образом мышечным листом, который покрывает длинную строку подключенных яичных камер5,6,7. Таким образом, для достижения надлежащей иммобилизации молодых яичных камер,различные подходы были разработаны, с участием покрытия яичные камеры с крышками 6,8,9 или гибкие одеяла4, 10 или встраивание их в низкоплавительную точку агарозы3,11. Эти подходы популярны, поскольку они также позволяют изображения большего визуального плана из-за тонкого уплощения окружной поверхности яичных камер.
Однако, недавно, было показано, что молодые яичные камеры (этап 1-8) вращаются вокруг их передней задней оси6 и что это движение ткани питается от тонкой сети актомиозина близко к окружной поверхности этих молодых яичных камер 12. Таким образом, искусственное изменение клеточной поверхности, вызванное тонким уплощением этой ткани, может негативно сказаться на поведении силового актомиозина. Контрапункт заключается в том, что если ткань яичной камеры не сплющена, микроскопическая визуализация белков на окружной поверхности яичных камер становится еще более ограниченной уменьшением размера плоскости приобретения.
Таким образом, мы объединили протоколы от Prasad et al.9 и лаборатории Селеста Берг4,10 и далее модифицировали их так, чтобы в разработанном методе не использовалось покрытие/гибкое одеяло/агароз. Дрозофилы яичные камеры свободно культивируются в средствах массовой информации и протокол, представленный здесь применяется только перевернутая микроскопия. Протокола две части. Первая часть сосредоточена на анализе сигналов атомиозина в локальном клеточном масштабе (до 15 клеток) в яйцеклетках. Во второй части мы фокусируемся на преодолении ограничений, связанных с небольшой плоскостью приобретения, вызванной бесплатной культивированием яичных камер. В этой связи мы разработали новый фиджийский вычислительный метод с полуинтерактивным графическим пользовательским интерфейсом, который выборочно извлекает и разворачивает определенные слои поверхности окружной ткани. За этим следует протокол, который описывает, как анализировать актомиозин в масштабе ткани (т.е. клетки. Поскольку селективная экстракция определенного тонкого слоя изогнутых эпителиальных тканей не была легковозможна с помощью классической проекции z-стека(рисунок1), этот простой в использовании метод служит важным условием для всестороннего понимания поведение тонкой (злт;1 мкм) сети актомиозина в масштабе ткани в яйцеклетках Drosophila.
Кроме того, для облегчения протокола, мы предоставляем пример замедленного фильмов (TLMs) и образцы файлов флуоресцентно помечены немышечной обычного поведения Миозина II (см. Дополнительный файл 3). Миозин II является моторным белком и представляет собой активную сократителемую часть актомиозина. Для того, чтобы изображение Myosin II, мы используем Drosophila трансгенных линий, которые содержат модифицированные нормативные световой цепи Myosin II называется MRLC::GFP (см. Таблица материалов для деталей)12,13. Для визуализации клеточных мембран протокол основан на коммерческих красителей (см. ТаблицуМатериалов). Этот протокол подходит не только для анализа малых субклеточных MRLC: GFP сигналы12, но и для любых аналогичных размеров субклеточных частиц вокруг 300 мкм, таких, как те, которые наблюдаются с Life-Act::GFP12,14.
Хотя оба эти протоколы представлены с использованием in vitro культивированных камер дрозофилы яйцо, приобретение сигналов actomyosin также может быть выполнена с использованием других тканей на оптимизацию культивирования средств массовой информации и в зависимости от наличия либо флуоресцентно помеченных белков с соответствующими коммерческими красителями или, например, микроинъекций мРНК для получения преходящих профилей экспрессии генов. Аналогичным образом, фиджийский протокол для извлечения тонкого слоя из окружной поверхности может быть применен в более общем плане к эллипсоидным и органоподобным тканям.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги и устранение неполадок для вскрытия и культивирования яичных камер
Если слишком много мух помещаются в небольшой флакон, муха пища может превратиться грязной после 2-3 дней из-за большого количества кормления личинок и взрослых мух попасть в ло?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы очень благодарны Мириам Остерфилд для обмена ее советы по in vitro жизни изображения яичных камер, используя подход, принятый из лаборатории Селеста Берг4. Мы также благодарим Себастьяна Тоси за сценарий Фиджи, который позволяет сегментации клеток.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
