Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

O desenvolvimento contínuo de novas tecnologias de imagem e software com aplicações nas ciências da vida tem proporcionado um enorme impacto na compreensão dos princípios básicos da vida. Um dos principais desafios é a visualização confiável dos processos de desenvolvimento em combinação com sua imagem ao vivo em vários tecidos. Os tecidos são partes de órgãos e corpos e, como tal, a maioria não são facilmente acessíveis para a imagem. Portanto, protocolos que permitam sua dissecção e cultivo in vitro foram desenvolvidos para Visualizar eventos biológicos que refletem suficientemente a situação in vivo dentro de um corpo vivo.

Ao longo das últimas décadas, a cultura e a imagem ao vivo de câmaras de ovos de Drosophila , estruturas acinares semelhantes a órgãos primitivos, contribuiu imensamente para a compreensão dos princípios básicos do desenvolvimento de órgãos primitivos^{1 , 2. º , 3}. atualmente, existem vários protocolos de cultivo disponíveis, e seu uso depende do tempo de aquisição, tipo de célula a ser imaged, e sua acessibilidade (por exemplo, germline interior vs. linha somática externa)⁴.

Uma característica comum em todos estes protocolos de cultivo é a necessidade para a imobilização de câmaras de ovo analisadas que exibem uma atividade contrátil elevada nos meios líquidos. A atividade contrátil das câmaras de ovos é causada principalmente pela folha muscular que abrange uma longa seqüência de câmaras de ovo conectadas^5,6,7. Portanto, para conseguir a imobilização adequada das câmaras de ovo jovens, várias abordagens foram desenvolvidas, envolvendo a cobertura de câmaras de ovo com coberturas^6,8,9 ou cobertores flexíveis^{4, 10} ou encaixá-los em agarose de ponto de fusão baixa^3,11. Estas aproximações são populares porque igualmente permitem a imagem latente de um plano Visual maior devido ao aplainamento subtil da superfície circunferencial das câmaras de ovo.

Entretanto, recentemente, mostrou-se que as câmaras de ovo novas (estágio 1-8) giram em torno de seu eixo anterior-posterior⁶ e que este movimento do tecido está alimentado por uma rede fina do actomiosina perto da superfície circunferencial destas câmaras ^{de ovo novas 12}. portanto, a alteração artificial da superfície celular causada por um achatamento sutil deste tecido pode ter um impacto negativo sobre o comportamento da maquinaria de actomiosina geradora de força. O contraponto é que se o tecido da câmara do ovo não é aplainado, a imagem latente microscópica das proteínas na superfície circunferencial de câmaras de ovo torna-se ainda mais limitada pelo tamanho diminuído do plano da aquisição.

Por isso, combinámos protocolos de Prasad et al.⁹ e o laboratório de Celeste Berg^4,10 e modificou-os ainda mais para que não se utilizava lamínula/manta flexível/agarose no método desenvolvido. As câmaras do ovo de Drosophila são cultivadas livremente nos meios e o protocolo apresentado aqui aplica-se somente a microscopia invertida. Há duas partes no protocolo. A primeira parte é focada na análise de sinais de actomiosina na escala celular local (até 15 células) dentro das câmaras de ovo. Na segunda parte, focamos em superar as limitações associadas a um pequeno plano de aquisição causado pela livre cultivo de câmaras de ovos. A este respeito, desenvolvemos um novo método computacional baseado em Fiji com uma interface de usuário gráfica semiinterativa que extrai e desdobra seletivamente camadas definidas de uma superfície circunferencial do tecido. Isso é seguido por um protocolo que descreve como analisar a actomiosina na escala tecidual (i.e., > 50 células). Como a extração seletiva de uma camada fina definida de tecidos epiteliais curvados não foi facilmente possível usando uma projeção de pilha z clássica (Figura 1), este método Easy-to-use serve como um pré-requisito importante para compreender compreensivamente o comportamento de uma rede de actomiosina fina (< 1 μm) na escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila .

Além disso, para facilitar o protocolo, fornecemos exemplos de filmes de lapso de tempo (TLMs) e arquivos de amostra de comportamento de myosin II convencional sem músculo fluorescentamente marcados (ver arquivo complementar 3). Myosin II é uma proteína do motor e representa a parte contrátil ativa da maquinaria do actomiosina. Para a imagem de myosin II, utilizamos linhas de Drosophila transgênicas que contêm uma cadeia leve regulatória modificada de miosina II denominada mrlc:: GFP (ver tabela de materiais para detalhes)^12,13. A fim de visualizar as membranas celulares, o protocolo é baseado em corantes comerciais (ver tabela de materiais). Este protocolo é apropriado não somente para a análise de mrlc subcellular pequeno:: sinais de GFP¹² mas também para todas as partículas subcellular de tamanho semelhante em torno de ± 300 μm, tais como aquelas observadas com vida-ato:: GFP^12,14.

Embora ambos estes protocolos sejam apresentados usando in vitro as câmaras de ovo cultivadas da Drosophila , a aquisição de sinais do actomiosina podem igualmente ser executadas usando outros tecidos em cima da optimização dos meios cultivando e dependendo da disponibilidade de proteínas com marcas fluorescentamente marcadas com corantes comerciais correspondentes ou, por exemplo, microinjeções de mRNA para obter perfis transitórios de expressão gênica. Similarmente, o protocolo Fiji-baseado para a extração de uma camada fina de uma superfície circunferencial pode ser aplicado mais geralmente aos elipsóide e órgão-como tecidos.