Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi
Summary
Bu protokol, tek hücrelerde ve kavisli epitelyal dokularda akomyosin davranışlarını nasıl güvenilir bir şekilde analiz ettiğini açıklayan basit yönergelerle birlikte Fiji tabanlı, Kullanıcı dostu bir metodoloji sunar. Öğretici izlemek için hiçbir programlama becerileri gereklidir; tüm adımlar Fiji grafik kullanıcı arayüzü ve ilişkili eklentileri kullanarak yarı interaktif bir şekilde gerçekleştirilir.
Abstract
Drosophila olgunlaşmamış Yumurtalar yumurta odaları denir ve onların yapısı geliştirme sırasında bir elipsoid şekle bir turda morfolojik değişiklikler geçmesi ilkel organlar benzer. Bu gelişimsel süreç oogenesis denir ve bir sonraki sinek nesil güvenli fonksiyonel Olgun yumurta üretmek için çok önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, yumurta odaları hayvan organı gelişimini anlamak için ideal ve ilgili bir model olarak hizmet vermiştir.
Çeşitli in vitro kültür protokolleri geliştirilmiştir, ancak bu protokoller için çeşitli dezavantajları vardır. Biri, onları hareketsiz ve analiz yumurta odalarının çevresel yüzeyinin görüntülenmiş edinme düzlemini artırmak için görüntülenmiş yumurta odalarında yapay bir basınç sağlayan çeşitli kapakları uygulama içerir. Böyle bir yaklaşım, uzun eksenleri etrafında yumurta odaları döndürmek için güç üreten ince akomyosin makinenin davranışını olumsuz etkileyebilir.
Böylece, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yumurta odalarının çevresi boyunca akomyosin makinelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek amacıyla medyada serbestçe Drosophila Egg Chambers kültürü sunuyoruz. Protokolün ilk bölümünde, yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) sınırlı bir satın alma düzleminde aktomiozin makinelerini nasıl analiz edebileceğiz hakkında ayrıntılı bir kılavuz sağlıyoruz. Protokol ikinci bölümünde, biz yumurta odaları ‘ çevresel yüzey tanımlanmış bir ince tabaka basit ekstraksiyon sağlayan yeni bir Fiji tabanlı eklentisi ile kullanıcılara sağlar. Aşağıdaki protokol daha sonra doku ölçeğinde (> 50 hücre) akomyosin sinyallerinin nasıl çözümleneceğini açıklar. Son olarak, bu yaklaşımların kısıtlamalarını hem yerel hücresel hem de doku ölçeklerde tespit ediyoruz ve potansiyel gelecekteki gelişimini ve olası uygulamalarını tartışıyoruz.
Introduction
Yeni görüntüleme ve yazılım teknolojilerinin yaşam bilimleri uygulamalarında sürekli gelişimi, yaşamın temel ilkelerini anlamakta büyük bir etki sağladı. Ana zorluklardan biri, çeşitli dokularda canlı görüntüleme ile birlikte gelişimsel süreçlerin güvenilir bir şekilde görselleştirilmesi. Dokular organlar ve organları ve bu nedenle, çoğunluğu kolayca görüntüleme için erişilebilir değildir. Bu nedenle, kendi diseksiyon ve in vitro kültür izin protokolleri yeterince canlı bir vücut içinde in vivo durumu yansıtmak biyolojik olayları görselleştirmek için geliştirilmiştir.
Geçtiğimiz yıllarda, Drosophila yumurta odalarının kültür ve canlı görüntülemesinde, ilkel organlara benzeyen acinar benzeri yapıların, ilkel organ gelişimi temel prensiplerinin anlayışına son derece katkı sağladı1 , 2 , 3. Şu anda, mevcut çeşitli kültür protokolleri vardır, ve kullanımı edinme süresi bağlıdır, hücre türü görüntülenmiş olması, ve onların Erişilebilirlik (örn., iç germline vs dış somatik hattı)4.
Tüm bu kültür protokollerinde ortak bir özellik sıvı medyada yüksek kontril aktivite gösteren analiz yumurta odaları immobilizasyon için ihtiyaç vardır. Yumurta odaları kontril aktivite bağlı yumurta odaları uzun bir dize kapsayan kas levha ağırlıklı olarak neden olur5,6,7. Bu nedenle, Genç yumurta odalarının düzgün immobilizasyonu elde etmek için, çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir, Cover,6,8,9 veya esnek battaniye 4 ile yumurta odaları kapsayan içeren, 10 veya düşük erime noktası agaroz3,11içine katıştırma. Aynı zamanda yumurta odalarının çevresel yüzeyinin ince düzleştirme nedeniyle daha büyük bir görsel düzlem görüntüleme izin olarak bu yaklaşımlar popülerdir.
Ancak, son zamanlarda, bu genç yumurta odaları (Aşama 1-8) onların anterior-posterior eksen etrafında döndürmek gösterilmiştir6 ve bu doku hareketi bu genç yumurta odalarının çevresel yüzeyine yakın ince bir aktomiozin ağ tarafından desteklenmektedir olduğunu 12. bu nedenle, bu doku ince bir düzleştirme neden hücresel yüzey yapay değişiklik kuvvet üreten aktomiozin makine davranışı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Kontrpuan, yumurta odası dokusu düzleştirilmiş değilse, yumurta odalarının çevresel yüzeyinde proteinlerin mikroskobik görüntüleme daha da satın uçak azalan boyutu ile sınırlı hale gelir.
Bu nedenle, Prasad ve al.9 ve Celeste Berg4,10 laboratuvarından birleştirilmiş protokollere sahibiz ve gelişmiş yöntemde hiçbir coverslip/esnek battaniye/agarose kullanılabilmesi için onları daha fazla değiştirdik. Drosophila yumurta odaları serbestçe medyada kültürlü ve burada sunulan protokol sadece ters mikroskopiye uygulanır. Protokole iki parça vardır. İlk bölüm, yumurta odaları içinde yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) akomyosin sinyallerinin analizine odaklanmıştır. İkinci bölümde, yumurta odalarının ücretsiz kültürü nedeniyle küçük bir satın alma uçağı ile ilişkili sınırlamaları üstesinden odaklanıyoruz. Bu bağlamda, biz seçici özler ve bir çevresel doku yüzeyi tanımlanan katmanları ortaya çıkaran bir yarı interaktif grafik kullanıcı arayüzü ile bir roman Fiji tabanlı hesaplama yöntemi geliştirdik. Bunun ardından doku ölçeğinde akomyosin nasıl çözümleneceğini açıklayan bir protokol izlenir (yani, > 50 hücre). Eğri epitelyal dokularda tanımlanmış bir ince tabakanın seçici olarak çıkarılması, klasik z-Stack projeksiyon kullanarak kolayca mümkün olmamıştır (Şekil 1), bu kolay kullanımlı Yöntem, önemli bir ön koşul olarak anlaşılır Drosophila yumurta odalarında doku ölçeğinde ince (< 1 μm) aktomiozin ağının davranışı.
Buna ek olarak, protokol kolaylaştırmak için, biz örnek zaman atlamalı Filmler (tlms) ve floresan etiketli kasa invaze olmayan konvansiyonel myosin II davranış örnek dosyaları ( ek dosya 3bakın) sağlar. Myosin II bir motor proteindir ve akomyosin makinenin aktif kontroton parçasını temsil eder. Myosin II görüntü için, biz myosin II adlandırılan mrlc değiştirilmiş bir düzenleyici ışık zinciri içeren Drosophila transjenik hatları kullanın:: GFP (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın)12,13. Hücre zarlarını görselleştirmek için protokol ticari boyalara dayanır (bkz. malzeme tablosu). Bu protokol sadece küçük hücre altı mrlc analizi için uygundur:: Gfp sinyalleri12 ama aynı zamanda ± 300 μM civarında herhangi bir benzer boyutlu hücre altı parçacıklar için, böyle yaşam-ACT ile gözlenen gibi:: Gfp12,14.
Her ikisi de bu protokoller içinde vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları kullanılarak sunulmasına rağmen, akomyosin sinyalleri satın alma da kültür medyanın optimizasyonu üzerine diğer dokularda kullanılarak yapılabilir ve kullanılabilirliği bağlı ilgili ticari boyalar veya örneğin, mRNA mikroenjeksiyonları geçici gen ifade profilleri elde etmek için floresan etiketli proteinlerin. Benzer şekilde, bir çevresel yüzeyden ince bir tabakanın çıkarılması için Fiji tabanlı protokol, elipsoid ve organ benzeri dokulara daha genel olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yumurta odalarının diseksiyonu ve kültürü için kritik adımlar ve sorun giderme
Eğer çok fazla sinekler küçük bir şişeye yerleştirilir, sinek gıda 2 – 3 gün sonra büyük miktarlarda besleme larvaları ve yetişkin sinek gıda sıkışıp almak sinek nedeniyle çamurlu açabilirsiniz. Böyle bir durumda, bu sineklerin geri kalanını taze yiyeceklerle yeni bir şişeye çevirin ve sayısını küçültür. Özellikle, gıda sıkışmış kadın hariç.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar çok Miriam Osterfield için bir yaklaşım Celeste Berg laboratuar4kabul kullanarak yumurta odaları in vitro yaşam görüntüleme onu tavsiye paylaşımı için minnettar. Ayrıca, hücre segmentasyonunu sağlayan Fiji senaryosu için Sebastian Tosi ‘ye teşekkür ederiz.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
