تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة
Summary
يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على فيجي وسهلة الاستخدام إلى جانب تعليمات مباشرة تشرح كيفية تحليل سلوك الكنتوموسين بشكل موثوق في الخلايا الفردية والأنسجة الظهارية المنحنية. لا توجد مهارات البرمجة المطلوبة لمتابعة البرنامج التعليمي. يتم تنفيذ جميع الخطوات بطريقة شبه تفاعلية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من فيجي والإضافات المرتبطة بها.
Abstract
ويسمى البيض Drosophila غير ناضجة غرف البيض، وهيكلها يشبه الأجهزة البدائية التي تخضع للتغيرات المورفولوجية من جولة إلى شكل القطع الناقص أثناء التنمية. وتسمى هذه العملية التنموية oogenesis وحاسمة لتوليد البيض ناضجة وظيفية لتأمين الجيل القادم ذبابة. لهذه الأسباب، كانت غرف البيض بمثابة نموذج مثالي وذي صلة لفهم تطور الأعضاء الحيوانية.
وقد وضعت عدة بروتوكولات الزراعة في المختبر، ولكن هناك العديد من العيوب لهذه البروتوكولات. واحدة يتضمّن التطبيق من تغطيات مختلفة أنّ يمارس ضغطة اصطناعيّة على ال يصور بيضة غرف [إين وردر تو] عاقمتهم وأن يزيد ال يصور اكتساب مستوى من السطح محيطيّة من ال يحلّ بيضة غرف. مثل هذا النهج قد تؤثر سلبا على سلوك آلات actomyosin رقيقة التي تولد القدرة على تدوير غرف البيض حول محورها أطول.
وهكذا، للتغلب على هذا القيد، ونحن ثقافة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام من أجل تحليل موثوق آلات actomyosin على طول محيط غرف البيض. في الجزء الأول من البروتوكول، نقدم دليل بالتفصيل كيفية تحليل آلات actomyosin في طائرة اقتناء محدودة على نطاق الخلوية المحلية (ما يصل إلى 15 خلية). في الجزء الثاني من البروتوكول، ونحن نقدم للمستخدمين مع البرنامج المساعد الجديد مقرها فيجي التي تسمح استخراج بسيطة من طبقة رقيقة محددة من سطح غرف البيض المحيطية. ثم يصف البروتوكول التالي كيفية تحليل إشارات الأتوموسين على مقياس الأنسجة (>50 خلية). وأخيرا، نحدد أوجه القصور في هذه النهج على كل من النطاقات الخلوية والأنسجة المحلية ونناقش تطورها المحتمل في المستقبل وتطبيقاتها الممكنة.
Introduction
وقد أدى التطوير المستمر لتكنولوجيات التصوير والبرمجيات الجديدة ذات التطبيقات في علوم الحياة إلى تأثير هائل على فهم المبادئ الأساسية للحياة. أحد التحديات الرئيسية هو التصور الموثوق به للعمليات التنموية بالاقتران مع تصويرها الحي في أنسجة مختلفة. الأنسجة هي أجزاء من الأعضاء والهيئات، وعلى هذا النحو، فإن الغالبية لا يمكن الوصول إليها بسهولة للتصوير. ولذلك، تم وضع بروتوكولات تسمح بتشريحها والزراعة في المختبر من أجل تصور الأحداث البيولوجية التي تعكس بما فيه الكفاية حالة في الجسم الحي داخل الجسم الحي.
على مدى العقود الماضية، وقد ساهم زراعة والتصوير الحي لغرف البيض Drosophila، هياكل تشبه acinar تشبه الأجهزة البدائية، بشكل كبير في فهم المبادئ الأساسية لتطوير الأعضاء البدائية1 , 2 , 3.حاليا، هناك العديد من بروتوكولات الزراعة المتاحة، واستخدامها يعتمد على وقت اكتساب، ونوع الخلية ليتم تصويرها، وسهولة الوصول إليها (على سبيل المثال، الجرثومية الداخلية مقابل الخط الجسدي الخارجي)4.
ومن السمات الشائعة في جميع بروتوكولات الزراعة هذه الحاجة إلى تجميد غرف البيض التي تم تحليلها التي تعرض نشاط ًا منضدية عالية في الوسائط السائلة. ويتسبب النشاط العقدي من غرف البيض أساسا من ورقة العضلاتالتي تغطي سلسلة طويلة من غرف البيض المتصلة 5،6،7. لذلك، لتحقيق الجمود السليم من غرف البيض الشباب، وقد وضعت نهج مختلفة،والتي تنطوي على تغطية غرف البيض مع الأغطية 6،8،9 أو البطانيات المرنة4، 10 أو تضمينها في منخفضة ذوباننقطة agarose 3،11. هذه النهج تحظى بشعبية لأنها تسمح أيضا بتصوير طائرة بصرية أكبر بسبب تسطيح خفية من سطح محيطي من غرف البيض.
ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن غرف البيض الشباب (المرحلة 1-8) تدور حول محورها الأمامي الخلفي6، وأن هذه الحركة الأنسجة مدعوم من شبكة actomyosin غرامة قريبة من السطح المحيطي من هذه الغرف البيض الشباب 12.ولذلك، فإن التغيير الاصطناعي للسطح الخلوي الناجم عن تسطيح خفية من هذا النسيج قد يكون لها تأثير سلبي على سلوك آلات actomyosin توليد القوة. والنقطة المضادة هي أنه إذا لم يتم تسطيح أنسجة غرفة البيض، فإن التصوير المجهري للبروتينات على السطح المحيطي لغرف البيض يصبح أكثر محدودية بسبب انخفاض حجم مستوى الاستحواذ.
لذلك، قمنا بالجمع بين بروتوكولات من Prasad وآخرون9 ومختبر سيليست بيرغ 4،10 وتعديلها مرة أخرى بحيث لا يتم استخدام غطاء / بطانية مرنة / أجاروز في الطريقة المتقدمة. يتم زراعة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام والبروتوكول المعروض هنا ينطبق فقط المجهرية المقلوبة. هناك جزأين للبروتوكول. ويركز الجزء الأول على تحليل إشارات الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (ما يصل إلى 15 خلية) داخل غرف البيض. في الجزء الثاني، نركز على التغلب على القيود المرتبطة بطائرة اقتناء صغيرة بسبب زراعة غرف البيض مجاناً. وفي هذا الصدد، قمنا بتطوير طريقة حسابية جديدة مقرها فيجي مع واجهة مستخدم رسومية شبه تفاعلية تستخرج وتتكشف بشكل انتقائي طبقات محددة من سطح الأنسجة المحيطية. ويلي ذلك بروتوكول يصف كيفية تحليل الكنتوموسين على مقياس الأنسجة (أي، >50 خلية). وبما أن الاستخراج الانتقائي لطبقة رقيقة محددة من الأنسجة الظهارية المنحنية لم يكن من الممكن بسهولة باستخدام إسقاط z-stack الكلاسيكي (الشكل1)، فإن هذه الطريقة السهلة الاستخدام بمثابة شرط مسبق هام لفهم الأنسجة الظهارية بشكل شامل سلوك شبكة أكميوسين رقيقة (<1 μm) على مقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا.
بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل البروتوكول، نقدم مثال أفلام الفاصل الزمني (TLMs) وملفات عينة من سلوك Myosin II التقليدي غير العضلي ذو العلامات الفلورية (انظر الملف التكميلي3). Myosin II هو بروتين محرك ويمثل الجزء التقلصي النشط من آلات actomyosin. من أجل صورة Myosin الثاني، ونحن نستخدم خطوط Drosophila المعدلة المعدلة التي تحتوي على سلسلة ضوء التنظيمية المعدلة من Myosin الثاني دعا MRLC::GFP (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)12،13. من أجل تصور أغشية الخلايا، ويستند البروتوكول على الأصباغ التجارية (انظر جدولالمواد). هذا البروتوكول هو مناسبة ليس فقط لتحليل الصغيرة دون الخلوية MRLC::GFP إشارات12 ولكن أيضا لأي جزيئات شبه خلوية مماثلة الحجم حول ± 300 درجة مئوية، مثل تلك التي لوحظت مع Life-Act::GFP12,14.
على الرغم من أن كلا البروتوكولين يتم تقديمها باستخدام غرف البيض Drosophila المستزرعة في المختبر، يمكن أيضا أن يتم الحصول على إشارات الactomyosin باستخدام أنسجة أخرى على الاستفادة المثلى من وسائل الإعلام زراعة واعتمادا على توافر من البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الأصباغ التجارية المقابلة أو، على سبيل المثال، الحقن المجهرية mRNA للحصول على ملامح التعبير الجيني العابر. وبالمثل، يمكن تطبيق البروتوكول القائم على فيجي لاستخراج طبقة رقيقة من سطح محيطي بشكل أعم على الأنسجة المثلة بالقطع الناقص والأعضاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتشريح وزراعة غرف البيض
إذا تم وضع الكثير من الذباب في قارورة صغيرة، يمكن أن يتحول الطعام يطير الموحلة بعد 2-3 أيام بسبب كميات كبيرة من اليرقات تغذية والذباب الكبار الحصول على المحاصرين في الغذاء يطير. في مثل هذه الحالة، الو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أصحاب البلاغ ممتنون جدا لميريام أوسترفيلد لتقاسم مشورتها على التصوير الحياة في المختبر من غرف البيض باستخدام نهج اعتمد من مختبر سيليست بيرغ4. كما نشكر سيباستيان تسي على الخط الفيجي الذي يمكّن من تجزئة الخلايا.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
