Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Die kontinuierliche Entwicklung neuartiger Bildgebungs- und Softwaretechnologien mit Anwendungen in den Biowissenschaften hat einen enormen Einfluss auf das Verständnis der Grundprinzipien des Lebens gehabt. Eine der größten Herausforderungen ist die zuverlässige Visualisierung von Entwicklungsprozessen in Kombination mit deren Live-Bildgebung in verschiedenen Geweben. Gewebe sind Teile von Organen und Körpern, und als solche sind die meisten für die Bildgebung nicht leicht zugänglich. Daher wurden Protokolle entwickelt, die ihre Zerlegung und In-vitro-Kultivierung erlauben, um biologische Ereignisse zu visualisieren, die die In-vivo-Situation innerhalb eines lebenden Körpers ausreichend widerspiegeln.

In den letzten Jahrzehnten hat die Kultivierung und Live-Bildgebung von Drosophila-Eikammern, acinarartigen Strukturen, die primitiven Organen ähneln, immens zum Verständnis der Grundprinzipien der primitiven Organentwicklung beigetragen^{1 , 2 , 3}. Derzeit stehen mehrere Kultivierungsprotokolle zur Verfügung, deren Verwendung von der Erfassungszeit, dem zu bildendem Zelltyp und ihrer Zugänglichkeit (z. B. innere Keimbahn vs. äußere somatische Linie)^{abhängt 4}.

Ein gemeinsames Merkmal in all diesen Kultivierungsprotokollen ist die Notwendigkeit der Immobilisierung analysierter Eierkammern, die eine hohe kontraktile Aktivität in flüssigen Medien aufweisen. Die kontraktile Aktivität der Eierkammern wird hauptsächlich durch das Muskelblatt verursacht, das eine lange Schnur von verbundenen Eierkammern^5,6,7bedeckt. Daher wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um eine ordnungsgemäße Immobilisierung junger Eierkammern zu erreichen, wobei Eikammern mit Abdeckungen^6,8,9 oder flexible Decken^{4, 10} oder einbetten sie in Niedrigschmelzpunkt-Agarose^3,11. Diese Ansätze sind beliebt, da sie aufgrund der subtilen Abflachung der Umfangsfläche der Eikammern auch die Bildgebung einer größeren visuellen Ebene ermöglichen.

In jüngster Zeit hat sich jedoch gezeigt, dass sich junge Eikammern (Stufe 1-8) um ihre vordere-hintere Achse⁶ drehen und dass diese Gewebebewegung von einem feinen Actomyosin-Netzwerk in der Nähe der Umfangsfläche dieser jungen Eikammern ^{angetrieben wird. 12}. Daher kann eine künstliche Veränderung der zellulären Oberfläche, die durch eine subtile Abflachung dieses Gewebes verursacht wird, einen negativen Einfluss auf das Verhalten der krafterzeugenden Actomyosin-Maschinerie haben. Der Kontrapunkt ist, dass, wenn das Eikammergewebe nicht abgeflacht wird, die mikroskopische Bildgebung von Proteinen an der Umfangsfläche von Eikammern durch die verminderte Größe der Erfassungsebene noch eingeschränkter wird.

Daher haben wir Protokolle von Prasad et al.⁹ und dem Labor von Celeste Berg^4,10 kombiniert und weiter modifiziert, so dass bei der entwickelten Methode kein Decksch-/flexible Decke/Agarose verwendet wird. Drosophila-Eikammern sind in den Medien frei kultiviert und das hier vorgestellte Protokoll gilt nur invertiert. Das Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil konzentriert sich auf die Analyse von Actomyosin-Signalen auf der lokalen Zellskala (bis zu 15 Zellen) in Eikammern. Im zweiten Teil konzentrieren wir uns auf die Überwindung der Einschränkungen, die mit einer kleinen Ankaufsebene verbunden sind, die durch die freie Kultivierung von Eierkammern verursacht wird. In dieser Hinsicht haben wir eine neuartige Fidschi-basierte Berechnungsmethode mit einer semi-interaktiven grafischen Benutzeroberfläche entwickelt, die selektiv definierte Schichten einer umlaufenden Gewebeoberfläche extrahiert und entfaltet. Es folgt ein Protokoll, das beschreibt, wie Actomyosin auf der Gewebeskala analysiert wird (d. h. >50 Zellen). Da die selektive Extraktion einer definierten dünnen Schicht gekrümmter Epithelgewebe mit einer klassischen Z-Stack-Projektion (Abbildung 1) nicht einfach möglich war, dient diese einfach zu bedienende Methode als wichtige Voraussetzung, um die Verhalten eines dünnen Actomyosin-Netzwerks auf der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern.

Darüber hinaus bieten wir zur Erleichterung des Protokolls Beispiel-Zeitrafferfilme (TLMs) und Beispieldateien mit fluoreszierend markiertem konventionellem Myosin-II-Verhalten (siehe Ergänzende Datei 3). Myosin II ist ein motorisch eskoproteinist und stellt den aktiven kontraktilen Teil der Actomyosin-Maschinerie dar. Um myosin II abzubilden, verwenden wir transgene Drosophila-Linien, die eine modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin II namens MRLC::GFP (siehe Tabelle der Materialien für Details)^12,13enthalten. Um Zellmembranen zu visualisieren, basiert das Protokoll auf kommerziellen Farbstoffen (siehe Tabelle der Materialien). Dieses Protokoll eignet sich nicht nur für die Analyse kleiner subzellulärer MRLC::GFP-Signale^12, sondern auch für alle subzellulären Partikel ähnlicher Größe um 300 M, wie sie mit Life-Act::GFP^12,14beobachtet wurden.

Obwohl beide Protokolle mit in vitro kultivierten Drosophila-Eikammern präsentiert werden, kann die Erfassung von Actomyosin-Signalen auch mit anderen Geweben bei der Optimierung der Kultivierungsmedien und je nach Verfügbarkeit durchgeführt werden. von fluoreszierend markierten Proteinen mit entsprechenden kommerziellen Farbstoffen oder beispielsweise mRNA-Mikroinjektionen, um transiente Genexpressionsprofile zu erhalten. In ähnlicher Weise kann das Fidschi-basierte Protokoll zur Extraktion einer dünnen Schicht von einer Umfangsoberfläche allgemeiner auf ellipsoide und organähnliche Gewebe angewendet werden.