ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

פיתוח מתמשך של הדמיה הרומן וטכנולוגיות תוכנה עם יישומים במדעי החיים סיפקה השפעה עצומה על הבנת עקרונות היסוד של החיים. אחד האתגרים העיקריים הוא ההדמיה המהימנה של תהליכים התפתחותיים בשילוב עם הדמיה חיה ברקמות שונות. רקמות הן חלקים של איברים וגופים, וככאלה, הרוב אינו נגיש בקלות להדמיה. לכן, הפרוטוקולים המאפשרים את הניתוח שלהם ובדיקת החוץ הגופית פותחו על מנת להמחיש אירועים ביולוגיים המשקפים בצורה מספקת את המצב הvivo בתוך גוף חי.

במהלך העשורים האחרונים, ההדמיה החיה של מתקני ביצים של דרוזוהילה , מבנים דמוי-שכבתית הדומים לאברים פרימיטיביים, תרמה רבות להבנת העקרונות הבסיסיים של פיתוח איברים פרימיטיביים^{1 ,} מיכל השני ^{, 3}. כיום, יש כמה פרוטוקולים culturing זמין, השימוש שלהם תלוי בזמן הרכישה, סוג התא כדי להיות בתמונה, ואת הנגישות שלהם (למשל, הפנימי germline מול קו הסומאטיק החיצוני)⁴.

תכונה נפוצה בכל הפרוטוקולים הללו culturing הוא הצורך השתק של תאי ביצה מנותח המציגים פעילות הקונקטילה גבוהה במדיה נוזלית. הפעילות הקונאקטעית של תאי ביצה נגרמת בעיקר על ידי גיליון השריר המכסה מחרוזת ארוכה של תאי ביצה מחוברים^5,6,7. לכן, כדי להשיג השתק מתאים של תאי ביצים צעירים, התפתחו גישות שונות, מעורבים כיסוי תאי ביצה עם מכסים^6,8,9 או שמיכות גמיש^{4, 10} או להטביע אותם בנקודת התכה נמוכה-ההיתוך^3,11. גישות אלה הן פופולריות כפי שהם גם מאפשרים הדמיה של מטוס חזותי גדול יותר בשל שיטוח עדין של המשטח ההיקפי של תאי הביצה.

עם זאת, לאחרונה, זה הוכח כי חדרי ביצה צעירים (שלב 1-8) לסובב סביב הציר האחורי שלהם⁶ וכי תנועה זו רקמה מופעל על ידי רשת actomyosin קנס קרוב למשטח ההיקפי של אלה ביצה ^{צעירים 12}. לכן, שינוי מלאכותי של משטח הסלולר הנגרם על ידי שיטוח עדין של רקמה זו עשויה להיות השפעה שלילית על התנהגות של מכונות הפקת כוח actomyosin. קונטרפונקט הוא כי אם הרקמה הקאמרית ביצה אינו משוטח, הדמיה מיקרוסקופית של חלבונים על פני השטח הcircumשל תאי ביצה הופך להיות מוגבל עוד יותר על ידי גודל ירידה של מטוס הרכישה.

לכן, יש לנו פרוטוקולים משולבים מ פראסאד ואח ‘⁹ ואת המעבדה של סלסט ברג^4,10 ועוד שונה אותם כך לא coverslip/שמיכה גמישה/agarose משמש בשיטה מפותחת. מרבית תאי הביצה מתורבתים באופן חופשי בתקשורת והפרוטוקול המוצג כאן חל רק מיקרוסקופ הפוך. . יש שני חלקים לפרוטוקול החלק הראשון מתמקד בניתוח של אותות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים) בתוך תאי ביצה. בחלק השני אנו מתמקדים בהתגברות על המגבלות הקשורות למישור הרכישה הקטן שנגרם כתוצאה מהתפירה החופשית של תאי הביצה. בהקשר זה, פיתחנו הרומן מבוססי פיג’י שיטה חישובית עם ממשק משתמש גרפי למחצה אינטראקטיבי באופן סלקטיבי ומתגלה שכבות מוגדרות של משטח רקמות. הדבר מלווה בפרוטוקול המתאר כיצד לנתח actomyosin בסולם הרקמה (כלומר, > 50 תאים). כמו החילוץ סלקטיבי של שכבה דקה מוגדרת של רקמות אפיתל מעוקל לא ניתן בקלות באמצעות הקרנת z-מחסנית קלאסית (איור 1), זו שיטה קלה לשימוש משמש כתנאי מוקדם חשוב להבין באופן מקיף את ה אופן הפעולה של רשת actomyosin דקה (< 1 μm) בסולם הרקמה בתאי ביצת דרוסופילה .

בנוסף, כדי להקל על הפרוטוקול, אנו מספקים למשל סרטים לפקיעה זמן (TLMs) וקבצים לדוגמה של מתויג בלתי שרירים רירן II התנהגות קונבנציונאלי (ראה קובץ משלים 3). רירן II הוא חלבון מוטורי ומייצג את החלק האקטיבי של המכונות actomyosin. כדי לדמות רירן II, אנו משתמשים הקווים הטרנסגניים הכוללים שרשרת אור שונה הרגולציה של רירן II בשם mrlc:: gfp (ראה טבלת חומרים לפרטים)^12,13. כדי להמחיש את קרום התאים, הפרוטוקול מבוסס על צבעים מסחריים (ראה טבלת חומרים). פרוטוקול זה מתאים לא רק לניתוח של mrlc קטן מסוג subcellular:: אותות gfp¹² אבל גם עבור כל החלקיקים בגודל זהה subcellular סביב ± 300 μm, כגון אלה שנצפו עם חיים-Act:: gfp^12,14.

למרות ששני הפרוטוקולים הללו מוצגים באמצעות מבחנה בתאי ביצה מחוץ לגופית, רכישת אותות actomyosin יכול גם להתבצע באמצעות רקמות אחרות על אופטימיזציה של מדיה culturing ובהתאם לזמינות של או פלואור מתויג חלבונים עם צבעים מסחריים מתאימים או, למשל, מיקרוזריקות mRNA כדי להשיג פרופילים של ביטוי גנים ארעי. באופן דומה, הפרוטוקול המבוסס על פיג’י להפקת שכבה דקה ממשטח משטח, ניתן ליישם באופן כללי יותר אליפסואיד ורקמות כמו איברים.