Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers
Summary
Dit protocol biedt een op Fiji gebaseerde, gebruiksvriendelijke methodologie, samen met eenvoudige instructies waarin wordt uitgelegd hoe u het gedrag van actomyosine in afzonderlijke cellen en gebogen epitheel weefsels betrouwbaar analyseren. Er zijn geen programmeervaardigheden vereist om de tutorial te volgen; alle stappen worden uitgevoerd op een semi-interactieve manier met behulp van de grafische gebruikersinterface van Fiji en bijbehorende plugins.
Abstract
Drosophila onrijpe eieren heten Eier kamers, en hun structuur lijkt op primitieve organen die morfologische veranderingen ondergaan van een ronde tot een ellipsoïde vorm tijdens de ontwikkeling. Dit ontwikkelingsproces wordt oögenese genoemd en is cruciaal voor het genereren van functionele volwassen eieren om de volgende vlieggeneratie te beveiligen. Om deze redenen hebben Eier kamers gediend als een ideaal en relevant model om de ontwikkeling van dierlijke organen te begrijpen.
Verschillende in vitro kweek protocollen zijn ontwikkeld, maar er zijn verschillende nadelen aan deze protocollen. De ene omvat de toepassing van verschillende covers die een kunstmatige druk uitoefenen op de afbeelding gemaakt Eier kamers om ze te immobiliseren en om het beeldoppervlak van de omtrek van de geanalyseerde Eier kamers te vergroten. Een dergelijke benadering kan een negatieve invloed hebben op het gedrag van de dunne actomyosine-machine die de kracht genereert om Eier kamers rond hun langere as te draaien.
Dus om deze beperking te overwinnen, cultuur we Drosophila Eier kamers vrij in de media om betrouwbaar actomyosine machines te analyseren langs de omtrek van de Eier kamers. In het eerste deel van het Protocol, bieden we een handmatige Details over het analyseren van de actomyosine machines in een beperkte acquisitie vliegtuig op de lokale cellulaire schaal (maximaal 15 cellen). In het tweede deel van het Protocol bieden we gebruikers een nieuwe plug-in op basis van Fiji waarmee de eenvoudige extractie van een gedefinieerde dunne laag van het omtrek oppervlak van de Eier kamers mogelijk is. Het volgende protocol beschrijft vervolgens hoe te analyseren actomyosine signalen op de weefsel schaal (> 50 cellen). Tot slot, we lokaliseren de beperkingen van deze benaderingen op zowel de lokale cellulaire en weefsel schalen en bespreken van de mogelijke toekomstige ontwikkeling en mogelijke toepassingen.
Introduction
De voortdurende ontwikkeling van nieuwe beeldvormings-en software technologieën met toepassingen in de biowetenschappen heeft een enorme impact op het begrijpen van de basisprincipes van het leven gegeven. Een van de grootste uitdagingen is de betrouwbare visualisatie van ontwikkelingsprocessen in combinatie met hun Live beeldvorming in verschillende weefsels. Weefsels zijn delen van organen en lichamen en als zodanig zijn de meeste niet gemakkelijk toegankelijk voorbeeld vorming. Daarom zijn protocollen die hun dissectie en in-vitro kweek mogelijk maken, ontwikkeld om biologische gebeurtenissen te visualiseren die de in vivo situatie in een levend lichaam voldoende weerspiegelen.
In de afgelopen decennia heeft de kweek en live beeldvorming van Drosophila Eier kamers, acinar achtige structuren die lijken op primitieve organen, enorm bijgedragen aan het begrijpen van de basisprincipes van primitieve orgaan ontwikkeling1 , 2 , 3. op dit moment zijn er verschillende kweek protocollen beschikbaar, en het gebruik ervan is afhankelijk van de acquisitie tijd, het celtype dat moet worden afgebeeld en hun toegankelijkheid (bijv. binnenste kiembaan versus buitenste somatische lijn)4.
Een gemeenschappelijk kenmerk in al deze kweek protocollen is de noodzaak voor de immobilisatie van geanalyseerde Eier kamers die een hoge contractiele activiteit in vloeibare media weergeven. De contractiele activiteit van de Eier kamers wordt voornamelijk veroorzaakt door het spier blad dat een lange reeks verbonden Eier kamers5,6,7bedekt. Om een goede immobilisatie van jonge Eier kamers te bewerkstelligen, zijn er daarom verschillende benaderingen ontwikkeld, waarbij de Eier kamers met dekstroken6,8,9 of flexibele dekens4worden bedekt, 10 of inbedden in een laag smeltpunt, agarose3,11. Deze benaderingen zijn populair omdat ze ook de beeldvorming van een groter visueel vlak mogelijk maken door de subtiele afvlakking van het omtrek oppervlak van de Eier kamers.
Onlangs is echter aangetoond dat jonge Eier kamers (fase 1-8) rond hun anterieure-posterieure as6 draaien en dat deze weefsel beweging wordt aangedreven door een fijn actomyosine-netwerk dicht bij het omtrek oppervlak van deze jonge Eier kamers 12. Daarom kan kunstmatige verandering van het cellulaire oppervlak veroorzaakt door een subtiele afvlakking van dit weefsel een negatieve invloed hebben op het gedrag van de kracht-genererende actomyosine machines. Het contrapunt is dat als het weefsel van de Eier kamer niet afgevlakt is, microscopische beeldvorming van eiwitten op het omtrek oppervlak van de Eier kamers nog beperkter wordt door de verminderde omvang van het acquisitie vlak.
Daarom hebben we protocollen van Prasad et al.9 en het lab van Celeste berg4,10 gecombineerd en verder aangepast zodat er geen afdekraam/flexibele deken/agarose wordt gebruikt in de ontwikkelde methode. Drosophila Eier kamers zijn vrij gekweekt in media en het protocol hier gepresenteerd geldt alleen omgekeerde microscopie. Het protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel is gericht op de analyse van actomyosine signalen op de lokale cellulaire schaal (tot 15 cellen) binnen de Eier kamers. In het tweede deel richten we ons op het overwinnen van de beperkingen in verband met een klein acquisitie vliegtuig veroorzaakt door het gratis kweken van eier kamers. In dit verband hebben we een nieuwe, op Fiji gebaseerde computationele methode ontwikkeld met een semi-interactieve grafische gebruikersinterface die selectief gedefinieerde lagen van een omtrek weefseloppervlak extraheert en ontvouwt. Dit wordt gevolgd door een protocol dat beschrijft hoe te analyseren actomyosine op de weefsel schaal (dat wil zeggen, > 50 cellen). Aangezien de selectieve extractie van een gedefinieerde dunne laag gebogen epitheelweefsel niet gemakkelijk mogelijk was met behulp van een klassieke z-stack projectie (Figuur 1), dient deze gebruiksvriendelijke methode als een belangrijke voorwaarde om de gedrag van een dun (< 1 μm) actomyosine-netwerk op de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers.
Om het protocol te faciliteren, bieden we ook voorbeeld time-lapse movies (Tlm’s) en voorbeeldbestanden van fluorescently gelabeld nonmuscle conventioneel myosin II-gedrag (Zie aanvullend bestand 3). Myosin II is een motor proteïne en vertegenwoordigt het actieve contractisch deel van de actomyosine machines. Om myosin II te kunnen afbeelden, gebruiken we Drosophila transgene lijnen die een gemodificeerde regelgevende licht keten van myosin II bevatten, genaamd mrlc:: GFP (Zie tabel met materialen voor details)12,13. Om celmembranen te visualiseren, is het protocol gebaseerd op commerciële kleurstoffen (Zie tabel met materialen). Dit protocol is niet alleen geschikt voor de analyse van kleine subcellulaire mrlc:: GFP signalen12 maar ook voor elke vergelijkbare grootte subcellulaire deeltjes rond ± 300 μM, zoals die waargenomen met Life-Act:: GFP12,14.
Hoewel beide protocollen worden gepresenteerd met behulp van in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, de overname van actomyosine signalen kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere weefsels op de optimalisatie van de kweekmedia en afhankelijk van de beschikbaarheid van ofwel fluorescently gelabelde eiwitten met overeenkomstige commerciële kleurstoffen of, bijvoorbeeld, mRNA-micro injecties om voorbijgaande genexpressie profielen te verkrijgen. Evenzo kan het op Fiji gebaseerde protocol voor de extractie van een dunne laag van een omtrek oppervlak meer in het algemeen worden toegepast op ellipsoïde en orgel achtige weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen en probleemoplossing voor de dissectie en het kweken van eier kamers
Als er te veel vliegen in een kleine injectieflacon worden geplaatst, kan het vlieg voedsel modderig worden na 2 – 3 dagen als gevolg van grote hoeveelheden voeden larven en volwassen vliegen gevangen in het vlieg voedsel. In een dergelijk geval, Flip de rest van deze vliegt in een nieuwe flacon met vers voedsel en krimpen hun aantal. In het bijzonder, uitsluiten vrouwtjes die vastzaten in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn Miriam Osterfield zeer erkentelijk voor het delen van haar advies over de in vitro Life beeldvorming van eier kamers met behulp van een aanpak die is overgenomen uit het Celeste berg Laboratory4. We danken ook Sebastian Tosi voor het Fiji-script dat celsegmentatie mogelijk maakt.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
