Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

1. preparación de las plantas de Arabidopsis Preparar 1 L de medio fuerza de vitaminas incluya medio Murashige y Skoog (MS) con 1% de sacarosa y ajustar el pH a 5.7 con hidróxido de potasio (KOH). Agregar 0,8% del phytoagar y autoclave durante 20 min a 120 ° C. Poner 75 mL de medio MS por placa de Petri (diámetro 14,5 cm, alto 3 cm) y permitir la solidificación durante 1 hora. Añadir 30 mg de semillas de Arabidopsis thaliana a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y superficie esterilizar con etanol al 70% (v/v) que contiene 0,05% (v/v) Triton X-100 durante 5 minutos, seguido por 100% etanol (v/v) durante 10 minutos eliminar el etanol. Transferir las semillas a papel de filtro estéril para el secado. Espolvorear las semillas esterilizadas uniformemente sobre una placa de MS (cada genotipo requiere placas de al menos 8-10) y sello de cada placa con cinta quirúrgica. Incubar las placas a 4 ° C durante dos días en la oscuridad para sincronizar la germinación de la semilla. Traslado a una cámara de crecimiento con el siguiente ciclo de luz: 8 h de 120 μmol m−2 s−1 luz y 16 h de oscuridad a 22-20 ° C. 2. preparación de perlas de agarosa HsIgG Suspender cuentas de agarosa CNBr-activado (4 g) en 100 mL de ácido clorhídrico de 1 mM e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Transferencia de las perlas de agarosa a un filtro de vidrio sinterizado, la colada bajo vacío con 100 mL de ácido clorhídrico de 100 mM y repita 2 – 3 veces.Nota: Preenfriar la solución de lavado a 4 ° C. Resuspender las perlas de agarosa en 1 mL de frío 100 mM HCl y transfiéralo a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Lavar el filtro de vidrio sinterizado con 3 mL de ácido clorhídrico de 100 mM y transferir el líquido al mismo tubo. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta.Nota: No decantar el tubo. Resuspender los granos en 50 mL de tampón de unión (tabla 1); Mezclar brevemente y luego vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Disolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) en 10 mL de tampón de Unión, mezcle suavemente las perlas de agarosa e incubar en agitador rotatorio durante la noche a 4 ° C. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta. Lavar las perlas de agarosa IgG con 50 mL de acoplamiento de buffer y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las perlas de agarosa IgG con 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo (tabla 1) y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Repetir una vez. Suspender cuentas de IgG-agarosa en 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo, gire la mezcla por 2 h a temperatura ambiente y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender las perlas de agarosa IgG en 200 mL de tampón de unión de NaCl (tabla 1). Para bloquear cualquier grupos restantes de CNBr Cross-linking, lavar las perlas de agarosa IgG con 100 mL de HCl de 0,1 M glicina-pH 2.8. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Lavar con 0.2 M glicina-HCl, pH 2.8, centrifugado a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Por último, lavar las perlas de agarosa IgG con 200 mL de agua ultrapura. Lavar las perlas de agarosa IgG con 200 mL de agua ultrapura y luego 200 mL de tampón PBS (tabla 1). Suspender las perlas de agarosa IgG en 20 mL de tampón PBS con 0,01% NaN3 (sódica) y almacenar a 4 ° C. 3. aislamiento y solubilización de la fracción de membrana Moler 10 g de plántulas de a. thaliana de tres semanas en nitrógeno líquido con un frío mortero y una maja de la arena. Añadir 20 mL de pulido buffer (tabla 1) a 10 g de tejido de tierra fría, mezcla bien y descongela el hielo. Filtrar el homogeneizado a través de dos capas de material de la filtración rápida en un tubo de centrífuga cónico de 50mL. Empapar el material de filtración rápida con el buffer antes de filtración de pulido. Centrifugar el filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C y transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL enfriado, repita el mismo paso una vez más y recoger el sobrenadante. Retener un 200 μL de muestra de la “fracción total” y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga mL 38,50 fría y superior a 35 mL con tampón frío de pulido. Centrifugar por 1 h a 100.000 × g a 4 ° C en una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Retener un 200 μL de muestra de la “fracción soluble” y tienda a-80 ° C para su posterior análisis. Resuspenda el precipitado verde utilizando un homogenizador de vidrio teflon, en tampón de pulir. Centrifugar durante 1 h a 100.000 x g a 4 ° C en una ultracentrífuga y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado verde en 18,75 mL de 1 x de Buffer utilizando un homogeneizador de vidrio teflon de pulido y añadir 9,375 mL de 1 x de tampón de pulir. Añadir 9,375 mL de solución de x solubilisation 4 (tabla 1) (contiene el TX-100 detergente) para dar 37,5 mL e incubar por 30 min en un “agitador rotativo” a 4 ° C. Centrifugar por 1 h a 100.000 × g a 4 ° C en una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Conservar una muestra de 200 μL del sobrenadante (futuro “fracción de la carga”) y tienda a-80 ° C para su posterior análisis. Resuspender el precipitado en 37,5 mL de tampón de pulir. Conservar la muestra de la parte insoluble y conservar a-80 ° C 4. inmunoprecipitación Equilibrar 100 μl de la resina de IgG-agarosa embalada en tampón A (tabla 1) y vuelta a 100 × g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender el IgG-agarosa resina en 100 μl de Buffer A 4 ° c. Transferencia de la resina lavada de IgG-agarosa al 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante una noche en un agitador rotatorio en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL a 4 ° C. Sedimento la IgG-agarosa resina en 100 × g por 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta. Retener un 200 μL de muestra del “flujo a través” y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis. Lavar la resina IgG-agarosa en 37,5 mL de tampón A e incubar por 10 min en un agitador rotatorio. Sedimento la IgG-agarosa resina en 100 × g por 5 min a 4 ° C, retirar el sobrenadante con una pipeta, añadir 5 mL del Buffer A un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 100 × g, 4 ° C, 5 minutos retener un 200 μL de muestra de la “colada de 1” y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis. Repetir 5 mL lavado paso tres veces con Buffer A. Llevar a cabo los dos últimos pasos de lavado sin los inhibidores (NaF, inhibidor de la proteasa y PMSF)Nota: Inhibidores ya no son necesarios en esta etapa y se omite para reducir los costos. Conservar una muestra de 200 μL de la última lavadora paso “lavado final (W6)” y tienda a-80 ° C para su posterior análisis. Transferencia de la resina de IgG-agarosa a una columna de centrifugado 500 μl con 35 μm filtro y lave los granos dos veces con 300 μL de tampón de elución de TEV (tabla 1) (no contiene AcTEV) para conseguir el equilibrio. Cerca de la columna de vuelta. Añadir 300 μL de tampón de elución de TEV que contiene 50 unidades (10 μl) de AcTEV. Preparar la mezcla en un tubo antes de agregar a la resina. Incubar la columna de vuelta con los granos en un Termomezcladores a 16 º C, 350 r.p.m. durante 2 h. invertir la columna suavemente varias veces cada 30 minutos. Abrir la columna de giro, colocarlo en un tubo limpio de 1.5 mL nuevo y vuelta a 100 × g por 5 min a 4 ° C para recoger el eluido. 10% (v/v) de la muestra eluída (~ 25 μl) en un evaporador centrífugo en seco (por ejemplo) y usar para espectrometría de masas u otros análisis más. Alícuota del efluente restante (~ 275 μL) divididas en once centrífuga de 1,5 mL tubos (25 μl cada una), seco en un evaporador centrífugo y almacenar a-80 ° C. Analizar las muestras retenidas durante todo el procedimiento, así como los eluatos por estándar SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para preparación de muestras, precipitado 50 μg de Total (T), carga (L), flujo (FT), lavar 1 (W1) y 200 μL de lavado 6 (W6) por Cloroformo/metanol extracción16. Añadir 10 μl de 2 x de tampón de carga SDS-PAGE (tabla 1) las muestras precipitadas y 25 μl de la muestra seca eluída. Mezclar y hervir durante 10 minutos a 95 ° C en un bloque de calor. Analizar la carga (L), flujo (FT), Total (T), lavado 1 (W1), lavar 6 (W6) y elución (E) immunoblotting usando anticuerpos anti-TOC159 para determinar la eficacia del procedimiento de aislamiento.