タップのタグを使用して葉緑体トランスロコン タンパク質複合体の親和性の浄化

1. シロイヌナズナの準備 1% スクロース培地、培 (MS) の中の含むビタミンの半分強の 1 L を準備し、水酸化カリウム (KOH) と 5.7 を pH を調整します。120 ° C で phytoagar と 20 分間のオートクレーブの 0.8% を追加します。 ペトリ プレートごと MS 培地の 75 mL を注ぐ (直径 14.5 cm、高さ 3 cm) 1 h の凝固を可能とします。 1.5 の mL および microfuge の管にシロイヌナズナ種子の 30 mg を追加、表面消毒 0.05% (v/v) を含む 70% (v/v) エタノール 5 分トリトン X-100 10 分 (v/v) エタノール 100% エタノールを削除します。 乾燥滅菌フィルター ペーパーに種子を転送します。(各遺伝子型が少なくとも 8 10 枚必要) MS 板に均等に滅菌の種子を振りかけるし、サージカル テープ、各プレートをシールします。 種子の発芽を同期する暗闇の中で 2 日間の 4 ° C で版を孵化させなさい。次の光の周期と成長の商工会議所への転送: 120 µmol m− 2の− 1 、光の 8 h と 16 h 22-20 ° c. で暗いの HsIgG アガロース ビーズ調製された2。 1 mM 塩酸 100 mL にエポキシ活性化アガロース ビーズ (4 g) を中断し、室温で 30 分間インキュベートします。 焼結ガラス フィルターにアガロース ビーズを転送し、100 mM 塩酸 100 mL で真空下で洗浄し、2-3 回繰り返します。注: Precool 洗浄液を 4 ° C アガロース ビーズ冷たい 100 mM 塩酸 1 ml と 50 mL の円錐形遠心チューブへの転送を再懸濁します。100 mM 塩酸 3 mL で焼結ガラス フィルターを洗って、同じ管に液体を転送します。 4 ° C で 5 分間 400 × gでスピンし、ピペットで上澄みを削除します。注: を行うチューブをデカントしてないです。 50 mL の結合バッファー (表 1) のビードを再停止しなさい一時的に、混ぜるし、4 ° C で 5 分間 400 × gでスピン 10 mL の結合バッファーで凍結乾燥、ホモ ・ サピエンスIgG (Hs IgG) の 50 mg を溶解、優しく、アガロース ビーズをミックスし、シェーカー 4 ° C で一晩で孵化させなさい 4 ° C で 5 分間 400 × gでスピンし、ピペットで上澄みを削除します。 50 ml の結合バッファーと 4 ° C で 5 分間 400 × gでのスピンの IgG アガロース ビーズを洗浄します。 4 ° C で 5 分間 400 × gで 50 ml のブロック バッファー (表 1) とスピンの IgG アガロース ビーズを再懸濁しますもう一度繰り返します。 50 mL のブロック バッファーで IgG アガロース ビーズを再懸濁します、RT に 2 h と 4 ° C で 5 分間 400 × gでのスピンのための混合物を回転させる 上澄みを除去し、200 mL の塩化ナトリウム結合バッファー (表 1) で IgG アガロース ビーズを再懸濁します。 任意の残りの架橋エポキシ基をブロック、100 ml の 0.1 M グリシン塩酸で pH 2.8 の IgG アガロース ビーズを洗ってください。4 ° C で 5 分間 400 × gで回転し、上清を削除します。0.2 M グリシン塩酸 pH 2.8、4 ° C で 5 分間 400 × gでのスピンで洗浄し、上清を除去します。最後に、200 ml の超純水の IgG アガロース ビーズを洗浄します。 純水 200 mL、200 mL の PBS バッファー (表 1) と IgG アガロース ビーズを洗浄します。 20 mL の 0.01% ナン3 (アジ化ナトリウム) PBS バッファーで IgG アガロース ビーズを再懸濁します、4 ° C で保存 3. 分離、膜画分の可溶化 砂で冷たい乳鉢と乳棒を使用して液体窒素で 3 週間シロイヌナズナ実生の 10 g を挽きます。 冷たい地面の組織 10 g にバッファー (表 1) を研削の 20 の mL を追加し、ミックスも、氷の上を解凍します。 50 mL の円錐形遠心チューブに簡単なろ過材の 2 つの層を介して磨砕液をフィルターします。ろ過の前にバッファーを砥石で簡単なろ過材を浸します。 4 ° C で冷やした 50 mL の円錐形遠心チューブに上清転送 1,500 × gで 10 分間遠心する濾液は、同じ 1 つのより多くの時間ステップし、上澄みを集めを繰り返します。「合計分数」の 200 μ L のサンプルを保持し、後で分析-80 ° C で保存 冷たい 38.50 mL 遠心チューブに上清を転送し、冷たい研削バッファーと最大 35 mL をトップします。100,000 × gで、超遠心機 4 ° C で 1 時間の遠心分離します。 50 mL の円錐形遠心チューブに上清を転送します。「可溶性」と後で分析-80 ° C でストアの 200 μ L のサンプルを保持します。 再研削のバッファーでガラス テフロン ホモジナイザーを使用して緑のペレットを中断します。100,000 × gで、超遠心機 4 ° C で 1 時間の遠心し、上清を捨てます。 ガラス テフロン ホモジナイザーを使用してバッファーを研削 x 1 の 18.75 mL で緑のペレットを再懸濁します、9.375 バッファーを研削 x 1 mL を追加します。 37.5 mL を与えるため、4 ° C で「回転シェーカー」上で 30 分間インキュベート 9.375 4 x solubilisation 溶液 mL (表 1) (テキサス州 100 洗剤) を追加します。 100,000 × gで、超遠心機 4 ° C で 1 時間の遠心分離します。50 mL の円錐形遠心チューブに上清を転送します。上清 (将来「負荷率」) と後で分析-80 ° C でストアの 200 μ L のサンプルを保持します。 バッファーを研削の 37.5 mL にペレットを再懸濁します。不溶性部分、-80 ° C でストアのサンプルを保持します。 4. 免疫沈降 (表 1) バッファー A に IgG agarose 樹脂パックと 4 ° C で 5 分間 100 × gでスピンの 100 μ L を平衡します。 上澄みを除去し、4 ° C でバッファー A の 100 μ L で IgG agarose 樹脂を再懸濁します 可溶化された膜の 37.5 ml 洗浄 IgG agarose 樹脂を転送し、4 ° C で 50 mL の円錐形遠心管中回転シェーカーで一晩インキュベート 土砂 IgG アガロースは 4 ° C で 5 分間 100 × gで樹脂し、ピペットで上澄みを除去します。「流れ」の 200 μ L のサンプルを保持し、後で分析-80 ° C で保存します。 37.5 mL のバッファー A に IgG agarose 樹脂を洗浄し、回転シェーカーで 10 分間インキュベートします。 土砂 100 × g 4 ° C で 5 分間で IgG agarose 樹脂ピペットで上澄みを除去、「洗浄 1」の 200 μ L サンプル 15 mL 遠心管と 4 ° C、5 分保持 100 × g で遠心分離機にバッファー A を研削の 5 mL を追加、-80 ° C で保存後で分析。 5 mL の洗浄バッファー A. と 3 回のステップを繰り返す インヒビター (NaF, PMSF とプロテアーゼ阻害剤) 最後の 2 つの洗浄手順を実行します。メモ: 阻害剤は、もはやこの段階で必要なコスト削減のため省略。最後洗濯手順”最終的な洗浄 (W6)」と、後で分析-80 ° C でストアの 200 μ L のサンプルを保持します。 35 μ m フィルターで 500 μ L スピン列に IgG agarose 樹脂を転送し、ビーズ TEV 溶出バッファー (表 1) の 300 μ L で 2 回 (AcTEV 含む) 平衡を洗ってください。スピン列を閉じます。 AcTEV の 50 単位 (10 μ L) を持つ TEV 溶出バッファーの 300 μ L を追加します。樹脂に追加する前にチューブのミックスを準備します。 スピン列 16 ° C で thermomixer でビーズをインキュベート、350 rpm のため 2 列を反転させる優しく数回 30 分毎。 スピン列を開き、新しいきれいな 1.5 mL チューブと溶出液を収集するために 4 ° C で 5 分間 100 × gでのスピンに配置します。 ドライ (例えば) 遠心蒸化器の溶出サンプル (〜 25 μ L) の 10% (v/v) と質量分析法や他のさらなる分析を使用します。 分注残り溶出液 (~ 275 μ L) で分けられる 11 1.5 mL 遠心チューブ (25 μ L 各)、遠心蒸化器で乾燥や-80 ° C で保存するには SDS-PAGE とイムノブロット標準手順として溶出を通して保有サンプルを分析します。試料の調製、沈殿物 50 μ g の合計 (T)、負荷 (L)、(フィート)、流れる洗浄 1 (W1) とクロロホルム ・ メタノール抽出16洗浄 6 (W6) を 200 μ l 添加します。 2 × SDS ページの読み込みバッファー (表 1) 沈殿したサンプルを 10 μ L と 25 μ L の溶出の乾燥サンプル追加します。渦と熱ブロック 95 ° C で 10 分間沸騰。 合計 (T)、負荷 (L)、(フィート) を通過、洗って 1 (W1) を分析分離処理の効率性を決定する抗 TOC159 抗体を用いたイムノブロット 6 (W6) と溶出 (E) を洗います。