Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

1. bereiding van Arabidopsis planten Bereiden 1 L van halve sterkte van Murashige en Skoog (MS) middellange inclusief vitaminen met 1% sacharose en breng de pH op 5.7 met kaliumhydroxide (KOH). Toevoegen van 0,8% van het phytoagar en autoclaaf gedurende 20 minuten op 120 ° C. Giet 75 mL MS voedingsbodem per plaat Petri (diameter 14,5 cm, hoogte 3 cm) en laat het stollen gedurende 1 uur. 30 mg van Arabidopsis thaliana zaden toevoegen aan een 1,5 mL microfuge buis, en oppervlak steriliseren met 70% (v/v) ethanol met 0,05% (v/v) Triton X-100 gedurende 5 minuten, gevolgd door 100% (v/v) ethanol voor 10 min. verwijderen de ethanol. Overbrengen steriel filter papier voor het drogen van de zaden. Strooi de gesteriliseerde zaden gelijkmatig op een bord van de MS (elk genotype vereist ten minste 8-10 platen), en elke plaat met chirurgische tape zegel. Incubeer de platen bij 4 ° C voor twee dagen in het donker te synchroniseren kieming van het zaad. Overdracht aan een groei-kamer met de volgende cyclus van licht: 8 h van 120 µmol m−2 s−1 licht en 16 h van dark bij 22-20 ° C. 2. voorbereiding van HsIgG Agarose kralen Schorten CNBr-geactiveerde agarose kralen (4 g) in 100 mL 1 mM HCl en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng de agarose kralen in een filter van gesinterd glas, wassen onder vacuüm met 100 mL 100 mM HCl en 2 – 3 keer herhalen.Opmerking: Precool de oplossing van de wash tot 4 ° C. Resuspendeer de agarose kralen in 1 mL koude 100 mM HCl en overdracht aan een tube van 50 mL conische centrifuge. Wassen van de filter van gesinterd glas met 3 mL 100 mM HCl en overbrengen van de vloeistof naar de dezelfde buis. Spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet.Opmerking: Geen decanteren in de buis. Resuspendeer de kralen in 50 mL koppeling buffer (tabel 1); Meng kort en draai vervolgens aan bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Los 50 mg gelyofiliseerd Homo sapiens IgG (Hs-IgG) in 10 mL buffer koppeling, meng de agarose-parels voorzichtig en incubeer in roteerapparaat ‘s nachts bij 4 ° C. Spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet. Wassen van de IgG-agarose kralen met 50 mL koppeling buffer en spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de IgG-agarose kralen met 50 mL blokkeerbuffer (tabel 1) en spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Eenmaal herhaald. Resuspendeer IgG-agarose kralen in 50 mL blokkeerbuffer, draai het mengsel voor 2 h bij RT en spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de IgG-agarose kralen in 200 mL NaCl koppeling buffer (tabel 1). Wassen als u wilt blokkeren alle resterende cross-linking CNBr groepen, de IgG-agarose kralen met 100 mL 0,1 M glycine-HCl, pH 2,8. Spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen met 0,2 M glycine-HCl, pH 2,8, spin op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Tot slot wassen de IgG-agarose kralen met 200 mL ultrazuiver water. Wassen van de IgG-agarose kralen met 200 mL ultrazuiver water en vervolgens 200 mL PBS buffer (tabel 1). Resuspendeer de IgG-agarose kralen in 20 mL PBS buffer met 0,01% NaN3 (natriumazide) en bewaren bij 4 ° C. 3. isolatie en solubilisatie van de membraan-breuk Het malen van 10 g van drie weken oud A. thaliana zaailingen in vloeibare stikstof met behulp van een koude mortier en een stamper met zand. Voeg 20 mL koude slijpen buffer (tabel 1) tot en met 10 g weefsel van de grond en meng goed op ijs ontdooien. Filtreer het homogenaat door twee lagen van snelle filtratie materiaal in een tube van 50mL conische centrifuge. Geniet van de snelle filtratie materiaal met het slijpen van de buffer voor filtratie. Centrifugeer het filtraat gedurende 10 min bij 1500 × g bij 4 ° C en breng het supernatant een gekoeld 50 mL conische centrifugebuis, herhaal hetzelfde nog een keer stap en het verzamelen van de bovendrijvende substantie. Een 200 µL monster van de “totale breuk” te behouden en op te slaan bij-80 ° C voor een latere anayse Breng het supernatant koud 38.50 mL ultracentrifuge buizen en bovenaan maximaal 35 mL met koude slijpen buffer. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 ° C in een ultracentrifuge. Het supernatant overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge. Behouden 200 µL eenmonstervan de “oplosbare fractie” en de winkel bij-80 ° C voor een latere anayse. Resuspendeer de groene pellet een glas teflon homogenizer, met slijpen buffer. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 ° C in een ultracentrifuge en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet van groen in 18,75 mL 1 x Buffer met behulp van een glas teflon homogenizer slijpen en voeg 9.375 mL 1 x slijpen buffer. Voeg 9.375 mL 4 x solubilisation-oplossing (tabel 1) (met het wasmiddel TX-100) te geven 37,5 mL en incubeer gedurende 30 minuten op een “roterende shaker” bij 4 ° C. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 ° C in een ultracentrifuge. Het supernatant overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge. Het behouden van een steekproef van 200 µL van de bovendrijvende substantie (toekomst “load fractie”) en de winkel bij-80 ° C voor een latere anayse. Resuspendeer de pellet in 37,5 mL buffer slijpen. Behouden van het monster van onoplosbare deel en winkel bij-80 ° C 4. Immunoprecipitation Equilibreer 100 µL van verpakte IgG-agarose hars in Buffer A (tabel 1) en spin bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de IgG-agarose hars in 100 µL van Buffer A bij 4 ° C. Breng de gewassen IgG-agarose-hars aan de 37,5 mL ontbindend membranen en na een nacht bebroeden op een roterende shaker in een 50 mL conische centrifugebuis bij 4 ° C. Sediment de IgG-agarose hars bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet. Behouden van 200 µL eenmonstervan de “stroom door” en opslaan bij-80 ° C voor een latere anayse. Wassen van de IgG-agarose hars in 37,5 mL Buffer A en incubeer gedurende 10 min op een roterende shaker. Sediment de IgG-agarose hars bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C, verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet, voeg 5 mL Buffer A slijpen naar een centrifuge tube van 15 mL en centrifuge op 100 × g, 4 ° C, 5 min. behouden 200 µL eenmonstervan de “Wash 1” en opslaan bij-80 ° C voor een latere anayse. Herhaal de 5 mL wassen van stap drie keer met Buffer A. Uitvoeren van de laatste twee stappen van het wassen zonder de remmers (NaF, Protease Inhibitor van de omwenteling en PMSF)Opmerking:-Remmers zijn niet langer nodig is in dit stadium en weggelaten om kosten te verminderen. Het behouden van een steekproef van 200 µL van de laatste wassen stap “definitieve wash (W6)” en de winkel bij-80 ° C voor een latere anayse. De IgG-agarose hars overbrengen in een 500 µL spin kolom met een 35 µm filter en wassen van de kralen tweemaal met 300 µL van TEV elutie buffer (tabel 1) (niet dat AcTEV bevat) voor de evenwichtsinstelling. Sluit de spin-kolom. Voeg 300 µL van TEV elutie buffer met 50 eenheden (10 µL) van AcTEV. De mix in een buis voor te bereiden voordat u toevoegt aan de hars. Incubeer de spin-kolom met kralen in een thermomixer bij 16 ° C, 350 rpm voor 2 h. omkeren de kolom zachtjes meerdere malen om 30 min. Open de spin-kolom, plaatst u deze in een nieuwe schone 1,5 mL-buis en de spin bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C voor het verzamelen van het eluaat. Droog (bijvoorbeeld) 10% (v/v) van het eluted monster (~ 25 µL) in een centrifugale verdamper en gebruiken voor massaspectrometrie of andere nadere analyse. Aliquot de resterende eluaat (~ 275 µL) verdeeld elf 1,5 mL centrifuge buizen (25 µL elk), drogen in een centrifugale verdamper en opslaan bij-80 ° C. Analyseer de monsters bewaard gedurende de procedure, alsmede de eluaten standaard SDS-pagina gevolgd door immunoblotting. Voor de bereiding van de monsters, overhaaste 50 µg voor totale (T), wassen Load (L), stromen door (FT), 1 (W1) en 200 µL van Wash 6 (W6) door de chloroform/methanol extractie16. Voeg 10 µL van 2 x SDS-pagina laden buffer (tabel 1) aan de geprecipiteerde samples en 25 µL van gedroogde monster geëlueerd. Vortex en kook gedurende 10 minuten bij 95 ° C in een blok van de warmte. Analyseren van de totale (T), Load (L), stromen door (FT), Wash 1 (W1), 6 (W6) en elutie (E) wassen door immunoblotting met anti-TOC159 antilichamen om te bepalen van de doeltreffendheid van de procedure van de isolatie.